CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)為遺傳疾病治療和生物醫(yī)學研究帶來了革命性突破，但其潛在的基因組安全性問題仍需深入探索。除已知的脫靶效應外，CRISPR誘導的染色體大范圍重排（Gross Chromosomal Rearrangements, GCRs）是另一重要風險，但其機制和檢測手段仍存在局限。近日，Advanced Science發(fā)表了安徽醫(yī)科大學卞坡團隊題為Assessment and Mitigation of CRISPR-Cas9-Induced Nontargeted Translocations的研究。該團隊通過開發(fā)新型報告系統(tǒng)，在野生型背景下高效檢測到CRISPR-Cas9誘導的非目標染色體易位（nontargeted translocations），并揭示了反向重復序列（Inverted Repeats, IRs）與Cas9切割位點鄰近對易位風險的調(diào)控作用，最后提出通過引入同源片段降低Cas9切割引起的基因組不穩(wěn)定的新策略。

1 背景與挑戰(zhàn)

IRs廣泛分布于多種物種基因組中（如人類基因組中約178個/Mb），易形成非B型DNA結(jié)構(gòu)，并與染色體斷裂熱點和基因組不穩(wěn)定性相關(guān)。現(xiàn)有研究多關(guān)注CRISPR介導的位點特異性易位（site-specific translocations），而非靶向易位（即隨機基因組位點間的異常連接）因缺乏有效檢測工具，其風險被嚴重低估。傳統(tǒng)報告系統(tǒng)依賴特定標記基因的重組，無法在野生型背景下全面評估易位事件。此外，IRs如何與CRISPR誘導的DNA雙鏈斷裂（DSBs）協(xié)同引發(fā)染色體易位，仍缺乏機制解析。

2 研究突破

研究團隊在大腸桿菌中構(gòu)建了三種新型報告系統(tǒng)：

基礎(chǔ)IR報告系統(tǒng)：通過雙lac操縱子設計，結(jié)合抗性基因標記（Amp和Kan），可區(qū)分點突變、片段缺失及易位事件。

短IR報告系統(tǒng)：分析不同長度IRs對易位頻率的影響。

全基因組報告系統(tǒng)：在113個基因組位點整合IR區(qū)域，評估Cas9切割與IRs距離、GC含量等因素的關(guān)聯(lián)。

3 關(guān)鍵發(fā)現(xiàn)

非靶向易位主導CRISPR遺傳風險：

Cas9切割位點與IRs的距離是決定易位頻率的關(guān)鍵因素（<4.5 kb時易位占比>98%）。IR長度與易位率呈負相關(guān)（r = -0.85），GC含量對易位影響次之。全基因組報告系統(tǒng)顯示，14%位點的易位率高達10^-2，顯著高于傳統(tǒng)認知。

4 分子機制解析：

單鏈退火（SSA）與替代末端連接（A-EJ）協(xié)同驅(qū)動易位：IRs通過分子內(nèi)SSA形成折疊結(jié)構(gòu)（FBs），經(jīng)SbcCD/RecA切割后，A-EJ利用微同源序列（2-28 bp）介導異常連接。λ-Red重組系統(tǒng)（Exo/Beta）通過促進SSA修復進一步加劇易位風險。

5 安全優(yōu)化策略：

引入與IR位點同源的DNA片段（如lacI基因同源序列）可顯著抑制FB形成，降低易位率，且不影響CRISPR編輯效率與精準性。傳統(tǒng)供體模板（donor templates）因同源性局限于Cas9靶點，對易位緩解效果有限，提示需針對IR區(qū)域設計特異性同源片段。

6 意義與展望

該研究首次系統(tǒng)性揭示了CRISPR-Cas9在IR鄰近區(qū)域誘導非目標易位的遺傳風險，并提出“同源競爭”策略，為開發(fā)更安全的基因編輯工具提供了新思路。

原文鏈接：https://advanced.onlinelibrary.wiley.com/doi/epdf/10.1002/advs.202414415

制版人：十一

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