脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）是一種嚴重危害人類健康的疾病，可導致損傷平面以下運動、感覺功能障礙，嚴重時可致截癱或癱瘓?。神經元丟失、軸突損傷、斷連和脫髓鞘導致功能障礙，而中樞神經系統（CNS）中成年神經元的低再生能力以及局部病變區域有害的微環境是脊髓損傷后修復失敗的主要原因。目前，脊髓損傷仍是一個全球性的醫學問題，缺乏安全有效的臨床治療方法。

近日，暨南大學粵港澳中樞神經再生研究院周立兵教授和蘇國輝院士團隊聯合中山大學附屬第一醫院付清玲教授團隊在細胞外囊泡期刊、國際細胞外囊泡學會官方會刊Journal of Extracellular Vesicles上在線發表題為Intranasal delivery of brain-derived neurotrophic factor (BDNF) loaded small extracellular vesicles for treating acute spinal cord injury in rats and monkeys的研究論文。該研究發現鼻腔遞送富含腦源性神經營養因子（BDNF）的間充質干細胞來源小細胞外囊泡/外泌體（MSCs-sEV）能夠有效進入腦和脊髓中并靶向富集于脊髓損傷處，對大鼠和猴SCI有顯著的治療效果。

1、成功制備出過表達BDNF的sEV

本研究應用前期建立的永生化MSCs細胞系，應用特有的基因修飾技術制備出過表達BDNF蛋白及mRNA的sEV，并應用大規模制備技術對sEV進行富集純化。通過納米追蹤、透射電鏡和Western blot對sEV特性進行鑒定，并通過ELISA對BDNF-sEV中的BDNF進行精準定量。結果表明，作者成功制備出BDNF-sEV，其可高效表達BDNF的蛋白及mRNA，并且具有良好的穩定性、高純度，不會損害其形態特征。

2、鼻腔遞送的sEV能有效進入大鼠脊髓中并富集于脊髓損傷處

在SCI大鼠中，作者應用mCherry熒光標記的sEV研究了鼻內給藥后sEV的生物分布。發現其均勻分布于嗅球和其他腦區，可在大多數神經元以及少量星形膠質細胞和小膠質細胞中觀察到。重要的是，在脊髓損傷區域可以觀察到富集的mCherry標記的納米顆粒。作者進一步應用免疫熒光法研究了不同細胞對sEV的攝取情況，結果發現鼻內遞送的sEV大部分被神經元攝取，只有少部分被星形膠質細胞和小膠質細胞攝取，表明其對神經元有偏好性。

3、評估BDNF-sEV和sEV在大鼠急性SCI中的治療效果

動物在SCI后兩小時及隨后4天每天一次接受BDNF-sEV鼻內給藥，作者在損傷后不同時間點進行行為學測試和肌電圖測試。結果發現：鼻內遞送BDNF-sEV、sEV均能促進SCI大鼠神經功能改善，且BDNF-sEV的效果優于sEV。MRI影像學結果同樣顯示：鼻內遞送BDNF-sEV、sEV均能促進SCI大鼠神經組織修復，且BDNF-sEV的效果優于sEV。

4、鼻腔遞送的sEV能有效進入猴腦組織和受損脊髓中并提高腦脊液中BDNF的表達。

由于嚙齒類動物脊髓損傷模型和脊髓損傷患者存在較大差異，為了使研究結果更接近于臨床，作者隨后采用在解剖學、生理學和遺傳背景上更接近于人類的食蟹猴建立脊髓損傷模型以進一步評估BDNF-sEV的潛在治療效果。作者發現：同樣，鼻腔遞送的sEV能成功進入猴腦組織和受損脊髓中并富集于脊髓損傷處，其中大部分進入神經元中，只有少部分進入星形膠質細胞和小膠質細胞中。此外，鼻內遞送BDNF-sEV能提高猴神經組織中BDNF的表達，這可能與其攜帶或遞送的BDNF的mRNA有關。

5、評估BDNF-sEV在猴急性SCI中的治療效果

作者進一步評估了BDNF-sEV在急性脊髓損傷猴中的治療效果。脊髓損傷猴接受了7次鼻內給藥BDNF-sEV。結果發現:鼻腔遞送BDNF-sEV同樣能明顯促進猴脊髓損傷后運動、感覺及神經傳導功能的恢復，并改善了后肢腓腸肌的萎縮情況。

綜上，該研究應用永生化MSC及工程化技術成功制備了高表達BDNF蛋白及mRNA的sEV，首次明確了鼻腔遞送sEV進入猴神經系統的可能性，并在大鼠和非人靈長類SCI模型中揭示了BDNF-sEV能夠發揮sEV和BDNF的雙重功效，具有顯著促進脊髓損傷后神經功能恢復的治療效果，極具臨床轉化應用前景。

暨南大學粵港澳中樞神經再生研究院博士后黃忠海為本論文的第一作者，暨南大學基礎醫學院副教授李靜和暨南大學附屬第一醫院骨外科醫生沃金博士為本論文的共同第一作者。暨南大學粵港澳中樞神經再生研究院周立兵教授、蘇國輝院士和中山大學附屬第一醫院付清玲教授為本論文的共同通訊作者。

原文鏈接：https://isevjournals.onlinelibrary.wiley.com/doi/epdf/10.1002/jev2.70066

專家點評

尹航教授（清華大學）

在本研究中，作者應用工程化技術成功制備了BDNF-sEV，并應用嚙齒類及非人靈長類急性脊髓損傷（SCI）模型，證實通過鼻內給藥可顯著促進脊髓損傷后神經功能恢復。作者發現，鼻內給予熒光標記的sEV可以有效到達大鼠和猴的受損脊髓區域，且主要被神經元攝取。sEV可以減少大鼠急性SCI后膠質細胞反應和促炎細胞因子表達，增強神經元存活和促進血管生成，且促進受損軸突的重新連接，延緩了運動神經元萎縮，并通過BDNF/TrkB信號傳導而改善功能。重要的是，本研究進一步應用非人靈長類驗證了上述效果，BDNF-sEV可有效抑制急性SCI猴的膠質細胞反應和促炎細胞因子表達，提高腦脊液中的BDNF水平，增強受損脊髓的神經網絡重連和功能恢復。

總體而言，本研究應用非人靈長類證實了工程化BDNF-sEV在治療急性SCI方面具有很大潛力。研究結果令人鼓舞，本研究非常嚴謹，功能分析做得很好，為SCI的臨床治療提拱了新的潛在治療靶點。通過基因編輯過表達或遞送功能因子產生功能增強型的工程化sEV是EV治療的重要方向，該研究提供了一種有效的工程化sEV策略。共同通訊作者中山大學附屬第一醫院付清玲教授連續兩屆擔任國際細胞外囊泡學會亞太大區常委，其長期致力于EV的轉化應用研究，這一重要成果也將進一步提升我國學者在EV領域的影響力。

專家點評

鄭磊教授（南方醫院）

作者研究了加載BDNF的小細胞外囊泡（BDNF-sEV）治療急性脊髓損傷（SCI）的潛力。作者應用基因編輯技術獲得了BDNF-MSC要，并在專利技術基礎上大規模制備出BDNF-sEV。應用經鼻給藥的方式證實了sEV可分布于中樞神經系統且主要聚集于脊髓損傷區區域，且主要被神經元攝取，通過行為和解剖學評估顯示大鼠及非人靈長類動物行為學及和神經功能均有顯著改善。機制研究發現BDNF-sEV可激活BDNF-TrkB信號通路、減少神經炎癥以及維持神經回路連接。該論文在非人靈長類動物模型中首次觀察到通過鼻內遞送的sEV在神經系統內的分布，首次提供了體內的重要證據，為鼻內遞送sEV在非人靈長類動物模型中的應用提供了新的見解，對開發針對神經系統疾病的sEV相關治療方法具有重要意義。總之，該研究應用猴子模型全面系統地證明了BDNF-sEV對SCI功能恢復的作用，數據可靠。這一研究受到國家重點研發計劃的資助，該項目由共同通訊作者中山大學附屬第一醫院付清玲教授為首席科學家，暨南大學周立兵教授和我院研究團隊等共同參與，以干細胞sEV臨床轉化應用為核心開展基礎機制研究和臨床研究，已取得多項進展，且正在開展多項有關干細胞sEV在神經系統疾病如腦卒中、漸凍癥、神經退行性疾病中的研究者發起的臨床研究，本研究是該項目的又一重要成果。

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