咖啡酸和綠原酸作為植物中廣泛存在的酚類化合物，近年來因其顯著的生物活性備受關注。咖啡酸具有抗炎、抗病毒和抗氧化等多種功效，在醫(yī)藥、化妝品和食品保鮮領域應用前景廣闊。而綠原酸作為咖啡和茶葉中的重要成分，則展現(xiàn)出抗糖尿病、抗癌和神經保護等特性，已成為營養(yǎng)保健品市場的明星成分。

然而，這兩種化合物在傳統(tǒng)生產方法卻面臨嚴峻挑戰(zhàn)——植物提取法受限于原料含量低（綠原酸在咖啡豆中僅占 5-10% 干重），且分離純化成本高昂；化學合成法則需使用強酸強堿和高溫高壓條件，環(huán)境友好性差。這些瓶頸嚴重制約了兩種化合物的廣泛應用。

近日，來自浙江工業(yè)大學的研究團隊通過多層次的代謝工程策略，成功改造大腸桿菌，使其能夠以葡萄糖為原料高效合成具有重要藥用價值的咖啡酸（CA）和綠原酸（CGA）。這項研究以題為“De novo Biosynthesis of Caffeic Acid and Chlorogenic Acid in Escherichia coli via Enzyme Engineering and Pathway Engineering”發(fā)表于 ACS Synthetic Biology，為工業(yè)化生產高附加值植物代謝物提供了新思路。

圖 | 展示了咖啡酸和綠原酸在大腸桿菌中的生物合成途徑

首先，研究人員從基因資源挖掘入手。他們在眾多微生物基因中尋找能高效催化合成咖啡酸的酪氨酸氨裂解酶（TAL）。經過在 NCBI 數(shù)據(jù)庫中仔細篩選和分析，他們發(fā)現(xiàn)了來自臺灣紅酵母（ Rhodotorula taiwanensis）的TAL（RtTAL）蛋白表現(xiàn)出眾，能夠初步實現(xiàn)催化合成咖啡酸。為了進一步提升它的性能，研究人員運用蛋白質工程技術，對 RtTAL 進行定向進化改造并成功獲得了突變體 RtTALT415M/Y458F，這個突變體的催化效率較野生型提升，有效解決了途徑中的限速步驟。

圖 | 通過定點突變和組合優(yōu)化提升 TAL 酶活性，并采用多種不同基因編輯策略，最終獲得高產菌株

大腸桿菌中的L-酪氨酸合成受到多種機制的嚴格調控。主要的調控元件包括兩種反饋抑制敏感酶，分別由 aroG 和 tyrA 編碼。基于此，通過共表達 RtTAL、hpaBC、aroGfbr 和 tyrAfbr，在大腸桿菌中構建了高效的 CA 生物合成途徑。

通過敲除競爭路徑基因 pheA 和調控基因 tyrR，并并過表達 aroGfbr 和 tyrAfbr。這些改造使得工程菌株 CA11 的咖啡酸產量達到 604.4 mg/L。

綠原酸是通過羥肉桂酰輔酶 A 奎寧酸羥肉桂酰轉移酶（HQT）將奎寧酸與咖啡酰輔酶 A (CA-CoA) 酯化而合成的。CA 轉化為 CA-CoA 由 4-香豆酸輔酶 A 連接酶（4CL2）介導。因此，研究人員采用了幾個策略提升綠原酸產量。

首先，他們通過理性設計對 HQT 酶進行改造，篩選出關鍵突變位點 I168L，使酶活性顯著提升 23.9%。在表達調控方面，團隊巧妙地運用核糖體結合位點（RBS）工程技術，通過系統(tǒng)篩選 25 種不同強度的 RBS 序列，最終確定中強度 RBS3 與 4CL2 組合時效果最佳，使 CGA 產量提升 25.1%。此外，研究人員還發(fā)現(xiàn)增強前體物質的供應可以提高綠原酸產量。他們通過過表達 ydiB、aroB、aroF 和 tktA 等基因構建了菌株 CGA13，成功增強前體供應。

圖 | 15 L 發(fā)酵罐中 CA 和 CGA 的生物合成

最終，在優(yōu)化 IPTG 濃度后，CGA13 菌株的綠原酸產量達到了 331.9 mg/L；在 15 L 發(fā)酵罐的分批補料發(fā)酵實驗中，產量達到 1.53 g/L。這表明重組大腸桿菌菌株 CA11 和 CGA13 分別在 CA 和 CGA 的工業(yè)生產中具有巨大的潛力。

參考文獻：

1.https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acssynbio.4c00850

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