亮氨酸（Leucine），是我們熟知的人體必需的支鏈氨基酸之一（BCAA），而亮氨酸-亮氨酸二肽（Leu-Leu）則是由兩個亮氨酸通過肽鍵連接而成的短肽，雖然結構簡單，但它的生理功能卻十分強大，在促進肌肉生長、加速恢復、緩解疲勞以及治療肌肉減少癥和代謝紊亂等領域都有著顯著功效。

過去，亮氨酸二肽主要通過化學合成法生產，但這種方法依賴有毒試劑（如碳二亞胺），步驟繁瑣且污染環(huán)境，酶合成法雖條件溫和、綠色環(huán)保，但受到天然酶合成速度的限制，導致產量極低。如何在保證亮氨酸二肽生產效率的同時，實現綠色、可持續(xù)的生產，成為亟待解決的問題。

近日，來自中國科學院天津工業(yè)生物技術研究所的孫周通團隊在 Journal of Agricultural and Food Chemistry 發(fā)表了一篇題為"Enhanced Production of Leucine?Leucine Dipeptide by Whole-Cell Catalysis"的研究。研究團隊發(fā)現了一種新型的L-氨基酸連接酶，并成功利用基因工程改造以及全細胞催化技術，實現亮氨酸二肽高達 23.85 g/L/d 的工業(yè)化級生產效率，創(chuàng)下該領域新紀錄。

研究人員首先通過數據挖掘技術，從假單胞菌中成功尋找到了一種新型的L-氨基酸連接酶（Lal）。這種酶在催化亮氨酸轉化為 Leu-Leu 的過程中表現出色，其催化效率遠高于之前報道的其他同類酶，是已知同類酶的 3.5 倍。

圖 | Lal-5 酶三維結構模擬圖

研究團隊通過 AlphaFold3 蛋白質結構預測技術揭示了 Lal-5 高效催化的分子機制——其活性位點的特殊構象能夠更緊密地結合底物，從而大幅提升反應速率。更令人振奮的是，這種酶具有 57 ℃ 的高熱穩(wěn)定性，因此能適應嚴苛的工業(yè)生產環(huán)境，為后續(xù)進一步改造奠定了良好的基礎。

然而，當研究人員將這種高效酶導入大腸桿菌時，卻發(fā)現實驗初期幾乎檢測不到 Leu-Leu 的積累，這主要是因為在微生物催化過程中，內源性肽酶的活性會分解 Leu-Leu，導致產量降低。面對這一問題，研究團隊采用 CRISPR-Cas9 基因編輯技術，精準敲除了大腸桿菌中的 pepA、pepB、pepD 和 pepN 四種肽酶基因，通過基因敲除，改造后的大腸桿菌能夠顯著減少 Leu-Leu 的降解，轉化率大幅上升至 69.9%，產量提升至 7.33 g/L/d。

此外隨著研究的深入，研究人員發(fā)現了另外的問題，即 Lal-5 合成亮氨酸二肽時需要大量 ATP 供能，而外源添加 ATP 的成本十分高昂。為了解決這一關鍵問題，研究人員引入了一種來自丹毒絲菌科的聚磷酸激酶（PPK）。這種酶能夠利用聚磷酸鹽將 ADP 轉化為 ATP，從而實現 ATP 的原位再生。最終，通過在大腸桿菌中共表達 Lal 和 PPK，研究人員成功構建了一個自給自足的 ATP 再生系統(tǒng)，使得 Leu-Leu 的生產不再依賴外部添加的 ATP，令生產成本降低 90% 以上。

圖 | ATP 循環(huán)系統(tǒng)工作原理圖，EbPPK 可利用多聚磷酸鹽（SHMP）將 ADP 再生為 ATP

優(yōu)化反應條件后，這種改造后的大腸桿菌在 12 小時內能夠達到 9.94 g/L 的 Leu-Leu 產量，時空產率達到了 23.85 g/L/d，這意味著一個1噸規(guī)模的發(fā)酵罐日產量可達 23.85 公斤，將能夠完全滿足工業(yè)化生產需求。

總之，這項研究的價值并不止于實現 Leu-Leu 的高效生產，其研究思路未來或可以廣泛應用于更多功能性肽類的綠色制造，如抗氧化肽、抗炎肽等，如論文通訊作者孫周通研究員所說：“我們正在設計更多‘細胞工廠’，未來或許能用細菌合成一切需要的分子。”

1.https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/acs.jafc.5c02080

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