近日，安徽農業(yè)大學園藝學院果實品質與保鮮團隊聯(lián)合華中農業(yè)大學和新西蘭植物與食品研究所等單位，在Plant Biotechnology Journal發(fā)表了題為“Spatial regulation of chlorophyll degradation in kiwifruit: AcNAC2-AcSGR1/2 cascades mediate rapid de-greening in the inner pericarp”的研究論文。該研究揭示了AcNAC2-AcSGR1/2級聯(lián)模塊調控獼猴桃內果肉快速褪綠的分子機制，并利用CRISPR/Cas9基因編輯技術突變關鍵NAC基因獲得褪綠延遲型獼猴桃。該研究為通過遺傳手段改良獼猴桃果肉色澤品質，選育快速褪綠獼猴桃種質資源提供了關鍵分子靶標。

色澤是果實品質分級的重要指標之一，果皮色澤的變化是番茄、香蕉、葡萄等眾多果實成熟的重要生理標志。然而，獼猴桃果實由褐色果皮包被，其果實色澤主要體現在果肉組織。特別是在黃肉、紅心等獼猴桃品種中，果肉完全褪綠是決定其商品價值的核心要素。前期研究表明，葉綠素降解是獼猴桃果肉褪綠的必經過程，對于類胡蘿卜素和花青素等呈色物質的展現起著關鍵的作用。因此，研究獼猴桃果實葉綠素降解的生物學機制是果實色澤品質改良的重要一環(huán)，也是實現不同色澤果實育種的重要基礎。

該研究在時空維度系統(tǒng)分析了黃肉紅心獼猴桃“紅陽”果實發(fā)育過程中內/外果肉相關色素指標的動態(tài)變化，發(fā)現內果肉的葉綠素降解速率明顯快于外果肉。由于內外果肉來自同一個果實，可確保發(fā)育階段的一致性，是挖掘葉綠素降解調控基因的理想試材。利用轉錄組測序，結合基因表達驗證和酶活性分析，獲得2個在內果肉顯著上調表達的葉綠素降解關鍵基因AcSGR1和AcSGR2。通過加權基因共表達網絡分析，發(fā)現AcSGR1/2的表達水平與9個候選差異轉錄因子均高度相關。后續(xù)煙草雙熒光素酶和EMSA實驗進一步證實，NAC轉錄因子AcNAC2能夠直接結合AcSGR1和AcSGR2的啟動子，顯著激活其表達（圖1）。熒光定量PCR結果顯示，相較于外果肉，AcNAC2在內果肉更早表達且表達量更高。系統(tǒng)進化樹分析發(fā)現，AcNAC2與AcNAC3高度同源，推測可能存在功能冗余。利用煙草雙熒光素酶，發(fā)現AcNAC3能夠微弱地激活AcSGR1和AcSGR2的表達，激活效應大約為1.5-1.6倍。以上結果說明，NAC家族成員在調控SGR基因表達方面可能存在一定的保守效應，其中AcNAC2可能發(fā)揮著主效作用。

圖1 AcNAC2正向調控葉綠素降解關鍵基因AcSGR1/2啟動子

為探究AcNAC2的生物學功能，該研究在獼猴桃中穩(wěn)定過表達AcNAC2并獲得3個過表達株系（AcNAC2#23，#43，#45；圖2）。與野生型（WT）相比，3個過表達株系均呈現明顯的黃化表型。隨后熒光定量PCR結果表明，AcNAC2的過表達能夠顯著誘導下游靶基因AcSGR1和AcSGR2的表達。

圖2 AcNAC2在獼猴桃中穩(wěn)定過表達分析

由于AcNAC2的過表達株系在后期繼代培養(yǎng)中表現出致死的表型，無法獲得生根植株進行后續(xù)研究。為進一步證實AcNAC2和AcNAC3在獼猴桃果實褪綠中的貢獻，該研究利用CRISPR/Cas9基因編輯技術，創(chuàng)制了早花的nac2nac3雙突變體植株（#173和#180）（圖3）。與野生型（WT）果實相比，突變體果實的果肉褪綠進程明顯延緩，且色度角和葉綠素含量則顯著升高。相較于WT果實，AcNAC2和AcNAC3以及下游靶基因AcSGR1和AcSGR2在突變體果實中的表達豐度也均顯著降低。綜上，該研究通過獼猴桃遺傳轉化結合分子生物學手段，揭示了獼猴桃不同果肉組織葉綠素差異代謝的關鍵NAC-SGR級聯(lián)調控通路，為不同色澤果實育種提供分子靶標。

圖3 nac2nac3雙突變體果實色澤表型及相關基因表達分析

安徽農業(yè)大學園藝學院為該論文的第一單位，安徽農業(yè)大學博士后吳瑩瑩和華中農業(yè)大學碩士研究生劉金鳳為論文共同第一作者，安徽農業(yè)大學殷學仁教授、華中農業(yè)大學曾云流副教授和新西蘭植物與食品研究所高級科學家Niels J. Nieuwenhuizen為論文共同通訊作者。安徽農業(yè)大學園藝學院23級本科生盛心源、王文球教授、汪松虎教授，新西蘭植物與食品研究所Andrew C. Allan院士、高級科學家Ross G. Atkinson、Marcela Martinez-Sanchez、王天池研究員，四川省農業(yè)科學院涂美艷研究員和浙江大學博士研究生鄧佳慧等參與了相關研究。

本論文研究得到了安徽農業(yè)大學博士后科學基金（03087003）、安徽農業(yè)大學高層次人才基金（rc322302）、浙江省自然科學基金（LZ23C150001）、四川省果樹育種專項（2021YFYZ0023-01）、浙江省育種專項（2021C02066-8）、國家自然科學基金（32272779）、湖北省重點研發(fā)計劃（2023BBB064）、中國農業(yè)科研體系專項基金（CARS-26）、新西蘭商業(yè)、創(chuàng)新和就業(yè)部以及部分來自獼猴桃品種和特許權使用費收入的PFR內部資金等項目的資助。劉金鳳的新西蘭訪學由中國留學基金管理委員會資助。

來源：安徽農業(yè)大學