：mRNA的非編碼區域5'UTR 和 3'UTR影響mRNA的穩定性和翻譯效率，其序列設計包括兩種常用的方法，一種是尋找天然調控蛋白翻譯的UTR序列，來源包括目標宿主或病毒；另一種是從頭設計構建工程化的UTR序列。尋找更有效的 5'UTR和3'UTR的最佳組合可能會提高mRNA療法的療效，有助于降低其劑量并減少不良反應。盡管mRNA療法的臨床前和臨床試驗眾多，但目前關于調節序列對異源RNA翻譯和穩定性影響的研究數量有限。

2024年，俄羅斯索契科學技術大學轉化醫學研究中心Vasiliy Reshetnikov等人在International Journal of Molecular Sciences發表文章：

Untranslated Region Sequences and the Efficacy of mRNA Vaccines against Tuberculosis

發表期刊: International Journal of Molecular Sciences

發表時間: 2024年1月

應用技術: mRNA序列設計、UTR序列篩選、mRNA二級結構預測、體外轉錄、RNA純化、LNP包封、體外試驗、細胞轉染、mRNA表達量、mRNA疫苗T細胞應答分析、體內動物試驗、病毒挑戰試驗。

01

研究背景

非翻譯區（UTR）是位于mRNA 編碼區上游和下游的非編碼序列。眾所周知，UTR 與 mRNA 翻譯過程有關。通過與 RNA 結合蛋白 （RBP） 和 microRNA 相互作用，UTR 影響 mRNA 翻譯效率和穩定性。一方面，在 5′UTR 中，存在一些影響翻譯效率的特定序列，包括末端寡嘧啶束 （TOP） 序列（由 7-14 個胞嘧啶和胸腺嘧啶殘基組成，形成 TCT 基序）、內部核糖體進入位點 (IRESs)、不依賴帽子的翻譯增強劑子（CITE）、上游開放閱讀框 （uORF）以及蛋白質結合基序。這些序列與反式蛋白相互作用，通過依賴或者不依賴帽子的翻譯途徑觸發翻譯，其翻譯效率取決于細胞狀態。另外一方面，富含AU的3′UTR決定著mRNA降解速率。

通常使用珠蛋白（Globin）基因序列確保高翻譯效率。特別是，人α-珠蛋白、人β-珠蛋白以及兔β-珠蛋白的基因序列常常被用來提高外源mRNA翻譯效率。兔 β-珠蛋白 mRNA 的 5′UTR 被認為可介導高效的帽依賴性翻譯，并且，其中不包含任何可能抑制翻譯過程的二級結構或序列元件。除了人珠蛋白基因的調控序列外，人熱休克蛋白HSP70和組蛋白H3的5′UTR序列也被用作外源mRNA的UTR。已在幾種細胞系中證實HSP70 5′UTR 介導翻譯具有通用性，而非細胞特異性。還有一些調節元件，如腺病毒 TPL，通過增強翻譯起始來提升蛋白表達 。歸納天然 5′UTR 的數據，我們可以得出這樣的結論：組成型表達基因的調節序列通常用于提升外源 mRNA 的翻譯效率。

與評估 5'UTR 影響的研究相比，評估外源3'UTRs 對目的蛋白表達水平的影響的研究要少得多。人珠蛋白基因的調控序列也用作 3′UTR，以確保 mRNA 的高穩定性和翻譯活性。Orlandini von Niessen等使用生物信息學技術對3′UTRs對穩定性和翻譯效率的影響進行了系統研究。他們發現，含有 mtRNR1 和 AES 的 3′UTR 促進基因表達。MtRNR1 是線粒體非編碼 12S 核糖體 RNA ，而AES 是分裂基因的 Groucho/Transducin 樣增強子家族的一個獨特成員，它調節雄激素受體基因的轉錄活性以及 Notch 和 Wnt 信號傳導，并充當腫瘤抑制因子。

02

UTR序列影響mRNA翻譯效率

研究人員構建了不同類型的5'UTR序列，將其與來自 mRNA-1273 的 3'UTR 組合設計了報告基因Luc mRNA；同時構建了多種3′UTR序列與來自 mRNA-1273 的 5′UTR 組合設計Luc mRNA。將上述不同的mRNA構建體轉染DC2.4 和 THP1細胞，檢測熒光素酶表達水平。

2.15'UTR序列對mRNA翻譯效率的影響

結果顯示，在轉染DC2.4細胞4h后，與來自mRNA-1273或者BNT162b2的5'UTR介導的熒光素酶翻譯效率相比，來自真核基因 HBB、HSPA1A、Rabb 和 H4C2的 5'UTR 、以及來自腺病毒TPL的 5'UTR可顯著增強熒光素酶翻譯水平。相比之下，在 DC2.4 細胞轉染后的后期時間點，這些UTR介導的翻譯效率差異消失。在 THP1 細胞系中，與C3 5'UTR序列介導的熒光素酶翻譯水平相比，來自人 β-珠蛋白 5'UTR 序列介導的Luc mRNA在轉染后 24 小時也顯示更高水平的熒光素酶表達。

總體來看，在細胞系之間觀察到不同5′UTR介導的mRNA 翻譯效率的差異表明5′UTR具有明顯的細胞特異性。為解決5′UTR導致的細胞間表達差異，青鳥核酸（RNASci）建立了天然及工程化5′UTR文庫，可用于不同mRNA、不同靶細胞的篩選實驗。詳細請聯系菌菌：199 2658 2926。

2.2 3'UTR序列對mRNA翻譯效率的影響

與 5'UTR 的結果類似，轉染含有不同 3'UTR 的 Luc RNA 后熒光素酶表達差異僅在 DC2.4 細胞系中觀察到。一方面，轉染后不同時間點的熒光素酶活性顯示3'UTR 序列 AES-HBB 和 mtRNR-HBB顯示介導表達最低水平的熒光素酶活性。由于 3'UTR 主要負責細胞中 RNA 的穩定性并防止通過與 microRNA 結合介導的 RNA 降解，因此結果表明3'UTR 序列 AES-HBB 和 mtRNR-HBB 會導致mRNA穩定性降低。另一方面，與mRNA-1273或BNT162B2 3'UTR 介導的翻譯相比，測試的 3'UTR 序列均未顯著提升熒光素酶表達水平。與 mRNA-1273 3'UTR 相比，即使是 3'UTR 序列 AES-EMCV——在轉染 DC2.4 細胞后 8 小時，在細胞中介導表達相對更高水平的熒光素酶活性—在 DC2.4 細胞轉染后 72 小時也顯示出介導表達更低水平的熒光素酶活性。與DC2.4 細胞系相比，在THP1細胞系中， AES-AES、AES-EMCV 和 AES-HBB介導表達的熒光素酶活性均比mRNA-1273或者BNT162B2 3'UTR介導的要低。

03

THP1 和DC2.4細胞翻譯機制特征

接下來，研究人員試圖回答細胞系翻譯機制的哪些特征可以解釋觀察到的 5'UTR 和 3'UTR 對翻譯效率影響差異的問題。為此，通過公開可用的轉錄組學數據，他們評估細胞系 THP1 和 DC2.4 中 RBP 基因的表達水平。結果顯示，THP1 和 DC2.4 細胞之間 85 個RBP基因的表達不同，其中20 個差異表達的RBP基因在本研究的UTR序列中具有假定的結合位點。

04

全面表征5'/UTR序列特征

研究人員試圖全面表征測試UTR序列，例如，對于5'UTR序列計算平均核糖體負荷（MRL），對于3'UTR序列計算吉布斯自由能。然后，分析 MRL 和 Gibbs自由能的值與細胞系轉染后生物發光相對水平數據的相關性。此外，在所有測試的 5'UTR 和3'UTR 序列中，都對 RBP 的結合位點進行搜索。

在DC2.4細胞中轉染4h，MRL與細胞中熒光素酶活性呈顯著相關性，而在轉染后24h和72h，MRL 與細胞中表達的熒光素酶活性呈微弱相關性。然而，在 THP1 細胞系中，這些參數之間沒有相關性。研究人員未能發現最小自由能 （MFE）（單獨 3'UTR 或整個 RNA）與細胞中表達的熒光素酶活性之間的相關性。

研究人員發現大多數測試 5′UTR 和 3′UTR 序列包含各種 RBP 的預測結合位點，其中許多直接影響 mRNA 的穩定性和翻譯效率。盡管如此，結合位點的存在與 RNA 穩定性之間的直接關系很難辨別，因為一些 RBP 穩定 RNA，一些破壞 RNA，而其他RBP需要根據細胞環境來調節 RNA 穩定性，如 PCBP2。還應該指出的是，目前，大多數 RBP 影響mRNA 穩定性和翻譯效率的研究不足，而且，這種影響很大程度上取決于結合區（5'UTR、ORF 或 3'UTR）和其他輔助蛋白的存在。

值得注意的是，前五個 UTR 中的三個（來自 HBB、Rabb 和 H4C2 mRNA）沒有 RBP 結合位點，而其他兩個（TPL 和 HSPA1A）攜帶 RBP 的結合位點，其對 RNA 穩定性的影響尚不清楚。關于 3'UTR，只有序列 mtRNR-mtRNR 和 mRNA-1273 3'UTR（兩者都產生最佳表達）包含 RBP 的預測結合位點 HNRNPK，它與穩定mRNA有關。

05

腺病毒TPL序列作為5'UTR開發結核疫苗

TPL 是腺病毒晚期 mRNA 的 5′UTR 中的核苷酸序列，以前被認為以不依賴帽的方式啟動晚期腺病毒 mRNA 的翻譯。TPL 包含一個內部核糖體進入位點，使其能夠獨立于與 mRNA 帽結構的相互作用募集核糖體。目前，尚不清楚 TPL 序列是否能夠以不依賴帽的方式啟動翻譯。

TPL 為 5'UTR 序列，在 DC2.4 細胞系中介導熒光素酶表達顯示出最佳結果，并且具有最高的 MRL，因此，研究人員在編碼針對結核分枝桿菌的多表位 mRNA 疫苗的構建體中選擇TPL 為 5'UTR，選擇來自mRNA-1273 的 3′UTR 。

對接種結核mRNA疫苗的小鼠進行 ELISpot 測定，計算分泌 IFNγ 的脾細胞，從而評估所疫苗觸發的T細胞反應的強度。與對照組小鼠脾臟細胞相比（注射PBS或者空殼LNP），TPL 為 5'UTR 序列的mRNA疫苗

刺激小鼠后，分泌 IFNγ的脾臟細胞數量明顯增加，而以mRNA1273-5'UTR作為5'UTR 序列的mRNA疫苗刺激小鼠后，分泌 IFNγ的脾臟細胞數量略微增加但不顯著。TPL - 5'UTR 結核疫苗刺激產生的分泌 IFNγ的脾臟細胞數量是mRNA1273-5'UTR結核疫苗的2倍多。

結核疫苗的接種會觸發遲發型超敏反應，與注射 LNP 的小鼠組相比，注射TPL - 5'UTR 結核疫苗的小鼠顯示結核菌素注射部位顯著擴大。另一方面，注射mRNA1273-5'UTR結核疫苗的小鼠結核菌素注射部與對照組無明顯差異。

小鼠注射兩劑結核疫苗后，在第42天進行結核菌攻毒，測定免疫小鼠肺部的細菌載量。與對照組小鼠脾臟細胞相比（注射PBS或者空殼LNP），TPL - 5'UTR 結核疫苗注射組肺部的細菌載量顯著降低，而注射mRNA1273-5'UTR結核疫苗的小鼠肺部的細菌載量降低了 >1.5 倍，但差異在統計學上不顯著。

綜上所述，5'-TPL-mEpitope-mRNA1273-3' 疫苗誘導了更強的適應性免疫和對結核分枝桿菌的保護。因此，選擇TPL 序列作為5′UTR可以顯著提高 mRNA 治療的有效性。

06

結語

在這項工作中，研究人員使用測試了多種來源（HBB 、 HSPA1A 、 Rabb、H4C2 或 TPL）的5' UTR 序列對Luc mRNA在DC2.4 細胞中翻譯的影響。結果發現，這些5′UTR介導的熒光素酶活性翻譯效率要高于mRNA-1273 和 BNT162b2 mRNA 疫苗的 5'UTR 序列介導的。接著，他們對這些5‘UTR序列進行了計算機分析并預測了 MRL 值，發現MRL 值與細胞中Luc mRNA表達的熒光素酶活性呈現相關性。最后，他們得到一種在細胞中具有最高翻譯效率和最高MRL值5′UTR，即腺病毒TPL序列，并基于此序列開發出一種針對結核分枝桿菌的多表位 mRNA 疫苗（5'-TPL-mEpitope-mRNA1273-3'），該疫苗可有效觸發T細胞免疫反應和高效的免疫保護。

目前，已公開的結核mRNA疫苗有兩種：第一種是基于全長 MPT83 抗原的 mRNA 疫苗，可觸發特異性結核抗體的產生；第二種是包含四種全長結核抗原（ID91）與TLR4 激動劑融合的 mRNA 疫苗。本研究首次使用TPL 序列作為5′UTR構建結核mRNA疫苗。與 mRNA-1273 的 5'UTR 相比，使用 TPL 作為 5'UTR 在小鼠中引起了更明顯的保護性適應性免疫反應，從而導致 mRNA 疫苗對結核病的臨床前療效更高。結核mRNA 疫苗的進一步優化可能包括增加編碼表位的數量、改變 cap 的類型（從 cap0 到 cap1）和調整劑量。使用 HBB來源的 5' UTR 也值得進一步研究。

參考文獻

[1] Reshetnikov V, Terenin I, Shepelkova G, Yeremeev V, Kolmykov S, Nagornykh M, Kolosova E, Sokolova T, Zaborova O, Kukushkin I, Kazakova A, Kunyk D, Kirshina A, Vasileva O, Seregina K, Pateev I, Kolpakov F, Ivanov R. Untranslated Region Sequences and the Efficacy of mRNA Vaccines against Tuberculosis. Int J Mol Sci. 2024 Jan 10;25(2):888. doi: 10.3390/ijms25020888.

[2] Zhang L, More KR, Ojha A, Jackson CB, Quinlan BD, Li H, He W, Farzan M, Pardi N, Choe H. Effect of mRNA-LNP components of two globally-marketed COVID-19 vaccines on efficacy and stability. NPJ Vaccines. 2023 Oct 11;8(1):156. doi: 10.1038/s41541-023-00751-6.

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撰寫| 工程菌星球

校稿| Gddra編審| Hide / Blue sea

編輯 設計| Alice