在當(dāng)今快速發(fā)展的食品工業(yè)中，葡萄糖作為一種重要的能量來源和食品成分，在食品生產(chǎn)和加工中占據(jù)著舉足輕重的位置。傳統(tǒng)的葡萄糖檢測方法如高效液相色譜法等不適用于現(xiàn)場快速檢測。

納米酶是一種人工合成的納米材料，具有類似天然酶的催化活性。優(yōu)異的催化性能和生物相容性使得納米酶成為構(gòu)建生物傳感器和檢測平臺的理想候選材料。熒光碳量子點（CQDs）作為一種新型的納米材料因其具有良好的光學(xué)性能和生物相容性以及易于合成等特點，在環(huán)境監(jiān)測、食品安全、生物成像和藥物輸送等領(lǐng)域受到了廣泛關(guān)注。

哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院的關(guān)樺楠、張明一、王丹丹等人采用食品廢棄物（玉米芯）通過一步水熱法綠色制備熒光CQDs，利用玉米芯熒光碳量子點（CFCD）過氧化物模擬酶活性及熒光特性構(gòu)建一套針對葡萄糖的檢測體系。該體系中葡萄糖氧化酶（GOx）與葡萄糖發(fā)生反應(yīng)產(chǎn)生H2O2，利用CFCD的模擬酶特性催化H2O2與2,2’-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（ABTS）反應(yīng)，形成綠色的氧化態(tài)ABTS（ox-ABTS），此外，CFCD模擬酶還可以催化H2O2產(chǎn)生羥自由基（·OH），CFCD模擬酶的熒光特性會被羥自由基猝滅，檢測機制如圖1所示。本研究旨在實現(xiàn)對體系中葡萄糖濃度的間接測量，為葡萄糖檢測技術(shù)的發(fā)展提供一種新思路。

1 CFCD的表征

如圖2A所示，CFCD納米粒子具有突出的納米結(jié)構(gòu)，呈球形顆粒，粒徑約為3 nm且無聚集現(xiàn)象。圖2B顯示在324 nm波長處CFCD具有明顯的紫外吸收峰，這歸因于C＝C中的π→π*和C＝O中的n→π*躍遷，由此可推斷出所制備的CFCD具有表面態(tài)捕獲激發(fā)態(tài)能量的特性。圖2C顯示CFCD在475 nm波長處出現(xiàn)一個明顯的熒光吸收峰，這可能是含芳香環(huán)、雜環(huán)的化合物可以發(fā)出熒光所致。進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn)，含氧官能團(tuán)的取代導(dǎo)致p共軛程度升高，從而使熒光強度增加。如圖2D所示，1 492 cm-1處的吸收峰為C＝C伸縮振動特征吸收峰，2 917 cm-1處的吸收峰對應(yīng)于C—H的特征吸收峰，3 327 cm-1處的吸收峰對應(yīng)于O—H的特征吸收峰。這表明所制備的CFCD納米粒子表面含有羥基、羧基等親水基團(tuán)，具有良好的親水性和生物相容性。

利用XPS 儀分析CFCD 所含特征元素。XPS 全譜圖分析結(jié)果表明，CFCD主要由C（285 eV）和O（532 eV）2種元素組成（圖3A）。由C1s高分辨譜顯示，CFCD主要含有C＝C（284.39 eV）和C—O（285.85 eV）2種官能團(tuán)（圖3B）；O1s高分辨譜顯示的兩個峰可歸結(jié)于C—OH（531.65 eV）和C—O（532.78 eV）官能團(tuán)（圖3C）。

2 CFCD模擬酶活性驗證及穩(wěn)態(tài)動力學(xué)分析

如圖4所示，CFCD-H2O2體系、CFCD-ABTS體系、H2O2-ABTS體系均未觀察到特征吸收峰或顏色變化，說明體系中沒有任何氧化還原反應(yīng)發(fā)生。只有當(dāng)CFCD、H2O2和ABTS共同存在的情況下，才能觀察到反應(yīng)溶液發(fā)生反應(yīng)變成綠色（曲線D），在420 nm波長處CFCDH2O2-ABTS體系具有明顯的紫外吸收峰，該峰是因為CFCD氧化ABTS為ABTS陽離子自由基，從而促進(jìn)了H2O2氧化還原生成羥自由基，羥自由基經(jīng)歷電子轉(zhuǎn)移以緩解ABTS的氧化。綜上所述，只有在CFCD、H2O2和ABTS同時存在時，CFCD才能模擬過氧化物酶的活性，催化H2O2產(chǎn)生大量的羥自由基，導(dǎo)致ABTS發(fā)生顏色變化。因此，說明該熒光CQDs具有過氧化物酶活性。

由圖5A、B可知，當(dāng)?shù)孜餅锳BTS且濃度固定時，隨著H 2 O 2 濃度增加，反應(yīng)初速度先迅速增加后逐漸平緩直至穩(wěn)定；當(dāng)?shù)孜餅镠 2 O 2 且濃度固定時，隨著ABTS濃度增加，反應(yīng)初速度的上升趨勢逐漸平緩。結(jié)果表明，當(dāng)ABTS濃度在0.1～7.5 mmol/L范圍內(nèi)，反應(yīng)初速度與ABTS的濃度之間符合典型的米氏方程。將催化反應(yīng)初速度倒數(shù)作為縱坐標(biāo)，將底物濃度倒數(shù)作為橫坐標(biāo)，構(gòu)建雙倒數(shù)曲線圖。如圖5C、D所示，對雙倒數(shù)曲線作線性擬合，可得出良好的正相關(guān)線性關(guān)系。通過雙倒數(shù)曲線的斜率和截距計算CFCD的催化動力學(xué)常數(shù)。以ABTS為底物時，

K

V

K

V

3 紫外-可見光比色法檢測體系優(yōu)化

3.1模擬酶檢測葡萄糖體系單因素試驗結(jié)果

CFCD納米材料在類過氧化物酶催化方面的表現(xiàn)受到反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間和納米材料添加量的影響。在不同溫度、反應(yīng)時間和CFCD添加量條件下進(jìn)行一系列實驗，以評估它們對催化效果的影響。如圖6A所示，隨著溫度從30 ℃升高到70 ℃，所制備的模擬酶材料催化性能逐漸增強。這可能是因為高溫能夠提高模擬酶的催化效率，加速反應(yīng)速率，導(dǎo)致吸光度的增加。因此，選擇50、60、70 ℃作為正交設(shè)計優(yōu)化試驗的溫度條件。

為了進(jìn)一步優(yōu)化CFCD模擬酶的催化活性，對底物的反應(yīng)時間進(jìn)行調(diào)整。如圖6B所示，在相同條件下，將反應(yīng)時間延長至20 min時，CFCD持續(xù)催化H2O2釋放羥自由基，進(jìn)一步氧化ABTS，導(dǎo)致反應(yīng)程度加劇，ABTS陽離子自由基累積增多，吸光度持續(xù)增加。然而，當(dāng)時間延長至25 min時，吸光度的變化趨于緩慢。這是因為隨著反應(yīng)時間的延長，CFCD模擬酶催化產(chǎn)生羥自由基的量達(dá)到了最大值，此后催化效果雖略有下降，但吸光度仍然較高。因此，選擇15、20、25 min作為正交設(shè)計優(yōu)化試驗的反應(yīng)時間。

如圖6C所示，當(dāng)CFCD添加量從100 μL增加至200 μL時，CFCD過氧化物模擬酶的性能逐漸增強，吸光度持續(xù)增加。這表明CFCD添加量的增加有助于提高酶的催化性能，產(chǎn)生大量具有強氧化活性的物質(zhì)（羥自由基）。然而，當(dāng)添加量從200 μL增加至300 μL時，模擬酶的催化性能開始下降，吸光度急劇減小。這可能是因為GOx催化葡萄糖產(chǎn)生的H 2 O 2 幾乎被消耗殆盡，導(dǎo)致反應(yīng)的吸光度變化不大。因此，選擇150、200、250 μL作為正交設(shè)計優(yōu)化試驗的CFCD添加量。

3.2模擬酶檢測葡萄糖體系正交試驗優(yōu)化

如表2所示，通過正交試驗分析，實驗各因素對反應(yīng)體系的影響程度排序為反應(yīng)溫度＞反應(yīng)時間＞CFCD添加量。結(jié)果表明，最優(yōu)檢測條件為反應(yīng)溫度70 ℃、反應(yīng)時間20 min、CFCD添加量為200 μL（即 A 3 B 2 C 2 ）。根據(jù)以上分析可知，反應(yīng)溫度是影響模擬酶催化體系的主要因素。通過對10 mmol/L葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行3 次獨立平行實驗，得到吸光度約為0.848，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.33%，這說明該模擬酶催化葡萄糖檢測系統(tǒng)具有良好的精密度。

4 熒光法檢測體系優(yōu)化

4.1模擬酶檢測葡萄糖體系單因素試驗結(jié)果

如圖7A所示，在30～60 ℃范圍內(nèi)，隨著反應(yīng)溫度的升高，熒光強度差值逐漸增大，這表明溫度升高有利于提高檢測體系的效果；在60～70 ℃時熒光強度差值隨溫度的升高而下降。這可能是因為GOx催化反應(yīng)需要氧氣的參與，而反應(yīng)溫度改變導(dǎo)致反應(yīng)體系中氧氣濃度發(fā)生變化，進(jìn)而影響酶活性。隨著溫度升高，反應(yīng)體系中氧氣的溶解度下降，導(dǎo)致葡萄糖的催化氧化反應(yīng)不完全，產(chǎn)生的H2O2減少。鑒于過高的反應(yīng)溫度不利于實時檢測，因此選擇50、60、70 ℃參與正交設(shè)計優(yōu)化試驗。

如圖7B所示，在5～10 min內(nèi)，隨著水浴時間的延長，體系的熒光強度差值增大。這是因為CFCD模擬酶在反應(yīng)過程中釋放活性需要一定時間，并且在5～10 min范圍內(nèi)，反應(yīng)時間越長酶活性越強。然而，在10～25 min時，隨著水浴時間的延長體系的熒光強度差值急劇下降，這是因為隨時間的延長GOx的活性降低。結(jié)果表明，反應(yīng)時間為10 min時催化體系反應(yīng)效果基本達(dá)到最優(yōu)，過長的反應(yīng)時間會影響葡萄糖反應(yīng)體系。因此，選擇5、10、15 min作為正交設(shè)計優(yōu)化試驗的反應(yīng)時間。

如圖7C所示，CFCD的添加量對體系的催化效果有顯著影響。當(dāng)CFCD添加量在100～200 μL范圍內(nèi)，CFCD過氧化物模擬酶性能隨添加量的增加而增強，熒光強度差值持續(xù)增大。在這個范圍內(nèi)，酶催化性能與添加量呈正比，因為CFCD催化H 2 O 2 產(chǎn)生大量的羥自由基。然而，當(dāng)添加量從200 μL增加到300 μL時，體系的熒光強度差值急劇下降。這可能是因為在分子氧存在下，GOx能氧化葡萄糖生成 D -葡萄糖酸內(nèi)酯，同時消耗氧生成H 2 O 2 。當(dāng)H 2 O 2 幾乎被消耗完時，CFCD持續(xù)增加對熒光強度的變化影響不大。因此，選擇150、200、250 μL作為正交設(shè)計優(yōu)化試驗的CFCD添加量。

4.2模擬酶檢測葡萄糖體系正交試驗優(yōu)化

如表3所示，通過正交試驗分析，實驗各因素對反應(yīng)體系的影響大小排序為反應(yīng)溫度＞反應(yīng)時間＞CFCD添加量。結(jié)果表明，最優(yōu)檢測條件為反應(yīng)溫度50 ℃、反應(yīng)時間10 min、CFCD添加量200 μL（即 A 1 B 2 C 2 ）。根據(jù)以上分析可知，反應(yīng)溫度是影響模擬酶催化體系的主要因素，而CFCD添加量和反應(yīng)時間對體系的影響較小。按照最優(yōu)方案對10 mmol/L葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行3 次獨立平行實驗，得到熒光強度差值約為5 818.571，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.47%，這說明該模擬酶催化葡萄糖檢測系統(tǒng)具有良好的精密度。

5 比色-熒光雙傳感檢測葡萄糖體系的工作曲線及檢出限

利用紫外-可見光比色法在最優(yōu)條件下檢測了不同濃度的葡萄糖。如圖8所示，在0.001～0.5 mmol/L范圍內(nèi)，吸光度與葡萄糖濃度呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，工作曲線回歸方程為 y ＝10.907 x ＋0.659 5（ R 2 ＝0.993 8），檢出限為1.305 5 μmol/L。在相同檢測體系下，分別檢測0.005、0.01、0.05 mmol/L葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液的吸光度。利用標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程對該比色檢測體系進(jìn)行回收率評價，結(jié)果顯示回收率分別為100.47%、96.28%和103.06%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于5%。這表明該比色生物傳感器具有高準(zhǔn)確度和穩(wěn)定性。

利用熒光法在最優(yōu)條件下檢測了不同濃度的葡萄糖。如圖9 所示，隨著葡萄糖濃度升高，體系熒光強度增大，熒光強度差隨之增加。葡萄糖濃度在0.001～0.1 mmol/L范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。工作曲線方程為

y

R

表4總結(jié)了基于CFCD比色-熒光雙傳感體系檢測葡萄糖的方法與其他CQDs檢測葡萄糖的已報道方法對比。相較于其他檢測方法，本研究所構(gòu)建的葡萄糖檢測方法具有相對較低的檢出限，突顯了基于CFCD比色-熒光雙傳感體系的高靈敏度。本研究中方法結(jié)合比色法的直觀性和熒光法的高靈敏度，使其在檢出限方面表現(xiàn)出了顯著優(yōu)勢，且熒光法具有更低的檢出限和更高的靈敏度，這使得基于CFCD的方法在檢測葡萄糖方面更具競爭力。

6 檢測體系選擇性分析

如圖10A所示，這些干擾物質(zhì)的濃度是葡萄糖的100 倍，但只有在反應(yīng)體系中加入葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液時才會產(chǎn)生較強的吸光度響應(yīng)。這表明只有葡萄糖發(fā)生了特異性氧化，產(chǎn)生了H 2 O 2 ，隨后被CFCD催化與ABTS反應(yīng)，使溶液顯綠色。如圖10B所示，只有葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液能夠與氧化酶發(fā)生反應(yīng)產(chǎn)生H 2 O 2 ，CFCD與其反應(yīng)產(chǎn)生羥自由基，猝滅自身熒光，從而形成熒光強度的差值。通過對比，說明該雙傳感檢測方法對葡萄糖具有較強的選擇性。

7 實際樣品檢測

在最優(yōu)條件下，對含有不同濃度葡萄糖的水蜜桃、白葡萄、雪碧和脈動溶液樣品進(jìn)行吸光度和熒光強度差值的檢測，并將結(jié)果代入工作曲線回歸方程，評估其加標(biāo)回收率。由于水蜜桃和白葡萄果肉中同時存在其他糖類物質(zhì)（如Fru和甘露糖），對GOx具有競爭抑制作用，導(dǎo)致葡萄糖氧化程度的降低和H 2 O 2 濃度的減小，因此葡萄糖的檢測效果也變?nèi)酢Ｑ┍毯兔}動溶液的甜味劑為白砂糖，是非還原性糖，加入氫氧化鈉溶液后會轉(zhuǎn)化為葡萄糖和Fru，從而可以測定其中葡萄糖的含量。如表5所示，該雙傳感檢測系統(tǒng)具有良好的加標(biāo)回收率。進(jìn)行3 次重復(fù)測定后，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于4%，表明比色-熒光雙傳感檢測系統(tǒng)具有良好的加標(biāo)回收率和精密度，因此具有實際樣品檢測的應(yīng)用潛力。

結(jié)論

基于GOx作用于葡萄糖反應(yīng)產(chǎn)生H2O2的特性，利用CFCD模擬酶催化反應(yīng)底物H2O2與ABTS產(chǎn)生顯色反應(yīng)，同時利用CFCD模擬酶活性以及可被羥自由基猝滅熒光的性質(zhì)，構(gòu)建了一種比色-熒光雙傳感檢測葡萄糖的體系。在紫外-可見光比色法最優(yōu)條件下，葡萄糖在0.001～0.5 mmol/L范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，檢出限為1.305 5 μmol/L。在熒光法檢測體系最優(yōu)條件下，葡萄糖在0.001～0.1 mmol/L范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，檢出限為9.249 7 nmol/L。根據(jù)工作曲線回歸方程，該比色-熒光雙傳感體系的回收率分別為96.28%～103.06%和96.31%～103.19%，表明該體系對共存分子表現(xiàn)出優(yōu)異的抗干擾能力。相較而言，熒光法檢測方法具有更低的檢出限和更高的靈敏度，因此更適用于實際樣品中微量物質(zhì)成分的檢測。

作者簡介

第一作者：

關(guān)樺楠，教授，江蘇科技大大學(xué)糧食學(xué)院糧油食品實驗中心主任，博士研究生導(dǎo)師，江蘇科技大學(xué)-糧油食品安全與營養(yǎng)團(tuán)隊學(xué)科帶頭人。現(xiàn)為教育部學(xué)位論文質(zhì)量監(jiān)測評審專家，中國糧油學(xué)會青年委員，教育部高等學(xué)校科學(xué)研究發(fā)展中心專家?guī)斐蓡T，中國食品報社、中國食品學(xué)院聯(lián)盟專家委員會委員，黑龍江省環(huán)境產(chǎn)業(yè)協(xié)會理事，黑龍江省環(huán)境產(chǎn)業(yè)專家?guī)鞂＜遥邶埥∈称房茖W(xué)技術(shù)學(xué)會青年委員，《Frontiers in Chemistry》等期刊客座編輯，《食品科學(xué)技術(shù)學(xué)報》等多家高水平中文核心期刊編委或青年編委，《Food Chemistry》等30余種SCI收錄期刊的特約審稿人。主要從事農(nóng)產(chǎn)品成分檢測分析及糧油食品加工催化的相關(guān)研究。先后獲得黑龍江省科學(xué)技術(shù)獎2 項，黑龍江省科技進(jìn)步獎1 項，梁希林業(yè)科學(xué)技術(shù)獎2 項；主持及參與完成課題31 項，其中，主持國家級課題3 項，省部級課題5 項；發(fā)表學(xué)術(shù)論文132 篇，以第一作者或單獨通信作者身份，在國內(nèi)外高水平學(xué)術(shù)期刊上發(fā)表學(xué)術(shù)論文88 篇，其中，SCI期刊收錄論文38 篇（1 篇為ESI高頻次引用論文），EI期刊收錄論文21 篇；授權(quán)專利18 項。作為主編撰寫全英文專著1 本，副主編撰寫國家高等學(xué)校規(guī)劃教材1 本，參編國家“十二五”規(guī)劃教材1 本，國家“十三五”規(guī)劃教材1 本。

本文《熒光碳量子點模擬酶比色-熒光雙傳感體系檢測葡萄糖》來源于《食品科學(xué)》2024年45卷第24期232-241頁，作者：關(guān)樺楠，張明一，王丹丹，張朱澤惠。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20240428-262。點擊下方閱讀原文即可查看文章相關(guān)信息。

實習(xí)編輯：王雨婷 ；責(zé)任編輯：張睿梅。點擊下方閱讀原文即可查看全文。圖片來源于文章原文及攝圖網(wǎng)。

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