小麥條銹病發生范圍廣、暴發性強、流行成災頻率高，常造成10-30%的小麥產量損失，甚至絕產，被農業農村部列入I類農作物病害。其病原菌作為活體營養專性寄生真菌，通過侵染結構吸器向小麥細胞分泌致病因子以抑制植物免疫，并向活體組織汲取營養物質。其侵染部位通常會出現葉綠素滯留，稱為“綠島”。綠島的形成通常被認為有利于病原菌通過延長寄主細胞活性以促進營養吸收。然而，活體營養型專性寄生真菌如何誘導寄主綠島形成以促進病害發生的分子機制仍然知之甚少。

近日，四川農業大學魏育明/許強教授團隊聯合西北農林科技大學王曉杰教授在Nature Communications在線發表了題為“A fungal pathogen suppresses host leaf senescence to increase infection”的研究論文，揭示了銹菌致病因子Pst_TTP1抑制TaTrx-TaSGR1模塊介導的葉片衰老及ROS積累，促進小麥感條銹病。

研究發現，敲除TaSGR1或TaTrx減弱小麥對條銹菌的抗性。蛋白互作手段鑒定小麥滯綠蛋白TaSGR1與硫氧還蛋白TaTrx在葉綠體中相互作用，硫氧還蛋白TaTrx行使氧化還原功能催化TaSGR1由寡聚體向單體的轉化，加速小麥組織衰老、H2O2積累和細胞死亡，增強了寄主抗性。而銹菌致病因子Pst_TTP1分泌到寄主細胞質中與硫氧還蛋白TaTrx結合，阻止TaTrx向葉綠體的轉運，進而抑制了葉綠體中TaTrx-TaSGR1級聯反應。綜上，該研究不僅闡明了植物利用葉綠體誘導活性氧促進葉片衰老以應對專性寄生真菌營養寄生的抗病機制。同時還發現了病原菌能夠利用這一機制促進作物感病。本研究為合理利用精準編輯開發葉綠體功能、打破病原菌的操縱，有效減輕作物病害發生、發展奠定了理論基礎。

以下是該研究的主要研究結果：

1. TaSGR1正調控小麥對條銹菌的抗性

前期研究篩選鑒定TaSGR1參與小麥抗條銹過程中，通過轉基因TaSGR1OE株系接種強致病力的條銹菌株CYR31和CYR34后，與對照Fielder相比，條銹菌生物量顯著降低了50%-60%，且產生顯著的過敏性壞死反應。而且，過表達植株TaSGR1OE葉片中的葉綠素含量顯著降低。組織細胞學觀察，轉基因TaSGR1OE株系接菌后產生大量ROS。而接種弱致病力條銹菌CYR23后，植株對條銹菌的抗病性減弱，tasgr1-ABD、tasgr1-AB和tasgr1-B植株均產生明顯的夏孢子。基于這些結果，表明TaSGR1在抗條銹病中起正調控作用。

圖1 TaSGR1正調控小麥對條銹菌的抗性

2. TaSGR1與葉綠體硫氧還蛋白TaTrx互作

運用酵母雙雜交篩選獲得TaSGR1互作蛋白TaTrx。酵母一對一驗證二者是發生互作。TaTrx與TaSGR1的STAYGREEN結構域互作，而與TaSGR1的富含半胱氨酸區域不互作。BIFC檢測到TaSGR1-TaTrx在葉綠體中有較強的互作熒光信號，免疫共沉淀表明TaSGR1蛋白與TaTrx有很強的相互作用。綜上結果表明，TaSGR1與葉綠體中的TaTrx相互作用。在Fielder植株中基因編輯TaTrx，tatrx-ABD植株接種條銹菌CYR23后，出現零星的夏孢子，真菌生物量增加了60%，表明TaTrx的缺失影響了小麥對條銹菌的抗性。

圖2 TaSGR1與葉綠體硫氧還蛋白TaTrx互作

3. TaTrx促進TaSGR1蛋白由寡聚體轉變為單體

對TaSGR1結構進行分析，預測到一個保守的富含半胱氨酸的基序可能會形成二硫鍵（C241、C245、C247、C248和C253）。將5個半胱氨酸突變后（TaSGR15A），寡聚TaSGR1蛋白無法形成。在體外實驗中，原核表達蛋白TaSGR1-His出現了寡聚化；用β-巰基乙醇處理后，僅檢測到單體TaSGR1。在轉基因TaSGR1OE株系中過表達TaTrx。TaTrx促進寡聚TaSGR1豐度的降低，但單體TaSGR1的豐度提高了，而酶活缺失突變體（TaTrxM）對此則沒有影響。在轉基因TaSGR1OE株系接菌后，TaSGR1單體豐度降低，表明TaSGR1可能被TaTrx從寡聚體還原為單體，而TaSGR1單體形式可能參與植物抗病反應。

圖3 TaTrx蛋白催化TaSGR1寡聚體向單體的轉變

4. Pst_TTP1阻止TaTrx進入葉綠體，抑制了TaSGR1的功能

對瞬時表達Pst_TTP1-HA-GFP或GFP的Fielder植株葉片進行細胞質葉綠體分離實驗。在表達GFP葉片的細胞質中，使用anti-Trx抗體檢測到TaTrx主要積累在葉綠體中，而在表達Pst_TTP1-HA-GFP的葉片中檢測到TaTrx蛋白在細胞質大量積累，這些結果表明Pst_TTP1阻止TaTrx進入葉綠體。以tatrx編輯材料為背景，過表達TaTrx或TaTrxM進行回補實驗，發現過表達TaTrx能夠恢復材料的抗性，而TaTrxM不能。在TaSGR1OE材料中表達Pst_TTP1和GUS、TaTrx和GUS以及TaTrx和Pst_TTP1，進行非變性凝膠電泳。結果發現瞬轉TaTrx促進TaSGR1寡聚體的解聚。而瞬轉Pst_TTP1抑制了TaSGR1的解聚。此外，還評估了Pst_TTP1對TaSGR1誘導的葉綠體ROS積累的影響。TaTrx和TaSGR1的共表達誘導葉綠體中ROS的大量積累。Pst_TTP1能夠抑制TaSGR1介導的葉綠體ROS的產生。因此，Pst_TTP1可能通過干擾TaTrx在葉綠體中的定位，從而削弱TaSGR1的功能并抑制植物免疫。

圖4 銹菌致病因子Pst_TTP1阻止TaTrx進葉綠體，抑制了TaSGR1的氧化還原

5. Pst_TTP1-TaTrx-TaSGR1作用機制

在受條銹感染的植物細胞中，銹菌致病因子Pst_TTP1被分泌并轉移到植物細胞質中，與葉綠體TaTrx硫氧還蛋白相互作用，阻止其進入葉綠體（圖5）。進而阻止TaTrx催化TaSGR1寡聚體向單體的轉化，減弱了TaSGR1的葉綠素酶活性，導致ROS積累減少，抑制了植物的防御反應。在鄰近未感染的細胞中（無Pst_TTP1），TaTrx正常調節葉綠體內TaSGR1氧化還原狀態，促進葉綠體ROS的積累（圖5）。

圖5 Pst_TTP1-TaTrx-TaSGR1模塊的作用模型

四川農業大學在讀博士研究生李悅和曲翔汝為論文共同第一作者。四川農業大學許強教授、魏育明教授和西北農林科技大學王曉杰教授為該論文的共同通訊作者。該研究獲得了國家自然科學基金、四川省自然科學基金、西南作物基因資源發掘與利用國家重點實驗室等的資助。

來源：四川農業大學