孕激素、雌/雄激素、皮質(zhì)激素等甾體激素藥物是臨床使用最為廣泛的藥物之一，全球獲準(zhǔn)上市的甾體藥物超過 400 種，年銷售額超過 1000 億美元（如圖 1）。據(jù) WTO 統(tǒng)計(jì)，全球甾體激素類原料藥類貿(mào)易規(guī)模總額在 300 億元，中國占總規(guī)模的 20% 左右。其中，中國在性激素類原料藥占全球貿(mào)易比重的 30%，在皮質(zhì)激素類原料藥占比重 13%。目前，甾體激素類原料藥和中間體的出口也成為了我國原料藥走向世界的重要品種。

圖 1 | 以黃體酮為核心骨架的甾體類藥物

近日，中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所戴住波、張學(xué)禮團(tuán)隊(duì)在植物中挖掘到一條高效合成黃體酮（孕酮）的生物合成途徑，其細(xì)胞區(qū)室空間定位不同于動(dòng)物細(xì)胞，植物源生物合成途徑獨(dú)立演化后，顯得更簡潔、更有組織力，能利用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成的膽固醇類物質(zhì)為底物原位直接合成甾體激素類化合物，從而避免進(jìn)入線粒體的復(fù)雜過程（如圖 2)。

基于這一發(fā)現(xiàn)，團(tuán)隊(duì)運(yùn)用合成生物學(xué)技術(shù)創(chuàng)建了人工本草細(xì)胞，其利用葡萄糖、乙醇等廉價(jià)碳源發(fā)酵生產(chǎn)甾體激素（甾體激素工業(yè) 3.0）的產(chǎn)量突破克級(jí)每升。該成果為探索生命的演化和利用異源仿生合成技術(shù)實(shí)現(xiàn)甾體激素藥物的可持續(xù)生產(chǎn)奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

圖 2 | 植物和動(dòng)物中黃體酮的生物合成途徑

由于直接提取動(dòng)物源甾體的方案存在不可持續(xù)性，甾體激素原料藥的工業(yè)化生產(chǎn)主要包括以下三代技術(shù)的發(fā)展：第一代技術(shù)（甾體激素工業(yè) 1.0）基于薯蕷皂素經(jīng) Marker 降解的半合成路線，即“薯蕷皂素-雙烯”法，但因原料依賴性強(qiáng)、環(huán)境污染嚴(yán)重逐漸被淘汰；第二代技術(shù)（甾體激素工業(yè) 2.0）轉(zhuǎn)向以植物甾醇為底物，利用微生物轉(zhuǎn)化生成 4-AD 和 HBC 等中間體，再經(jīng)化學(xué)或酶等方法修飾合成目標(biāo)藥物，降低對(duì)植物資源的依賴，現(xiàn)為主流工藝；而第三代技術(shù)（甾體激素工業(yè) 3.0）致力于構(gòu)建微生物細(xì)胞工廠，通過葡萄糖等廉價(jià)原料直接發(fā)酵合成甾體藥物，被視為綠色生物制造的終極方向。

盡管第三代技術(shù)自 20 世紀(jì) 90 年代已通過異源表達(dá)動(dòng)物源 P450scc 系統(tǒng)（P450scc，催化膽固醇到甾體激素的守門酶）實(shí)現(xiàn)了甾體藥物的微生物從頭合成，但其產(chǎn)業(yè)化仍面臨挑戰(zhàn)——該酶的低催化活性及線粒體區(qū)室化等多因素致使該路線至今未能突破產(chǎn)業(yè)化效率瓶頸（產(chǎn)物滴度約 100 mg/L）。

本研究在富含 C21 甾體皂苷的夾竹桃科藥用植物通關(guān)藤中解析了黃體酮的完整生物合成途徑。該途徑包含四個(gè)關(guān)鍵酶：兩個(gè) P450scc 酶（MtCYP108 和 MtCYP150）以及兩個(gè) 3β-羥基類固醇脫氫酶/Δ5-Δ4 酮基類固醇異構(gòu)酶（MtHSD5 和 MtHSD6）。并意外發(fā)現(xiàn)其與動(dòng)物來源的 P450scc 不同，植物來源的 P450scc 定位于植物和酵母的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中（這是其底物膽固醇類物質(zhì)的合成區(qū)室），并使用植物型細(xì)胞色素 P450 還原酶（CPR）作為電子傳遞鏈。植物來源的 HSD 酶在植物和酵母的細(xì)胞質(zhì)中發(fā)揮作用，而動(dòng)物來源的 HSD 則定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。這使得植物源生物合成途徑通過獨(dú)立演化后，在空間上避免底物和酶在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、細(xì)胞質(zhì)、線粒體等區(qū)室中的反復(fù)穿梭，從而更簡潔、更有組織力（如圖 2，3）。

基于這一發(fā)現(xiàn)，研究團(tuán)隊(duì)利用合成生物學(xué)和代謝工程手段構(gòu)建了基于酵母的細(xì)胞工廠，其能夠利用簡單碳源發(fā)酵合成1.06 g/L的黃體酮（如圖 4）。該成果為探索生命的演化和利用異源仿生合成技術(shù)實(shí)現(xiàn)甾體激素藥物的可持續(xù)生產(chǎn)奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

圖 3 | 植物 P450scc 和 HSD 的亞細(xì)胞區(qū)室定位

圖 4 | 黃體酮高效細(xì)胞工廠的創(chuàng)建

這項(xiàng)工作得到合成生物學(xué)國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、國家自然科學(xué)基金等項(xiàng)目的資助，相關(guān)成果已經(jīng)發(fā)表在 Metabolic Engineering 期刊上，并申請專利 5 項(xiàng)。天津工業(yè)生物技術(shù)研究所博士研究生李榮生為該論文的第一作者，高級(jí)工程師王冬、碩士研究生郭爽等為共同作者，天津工業(yè)生物技術(shù)研究所、國家合成生物技術(shù)創(chuàng)新中心戴住波研究員和張學(xué)禮研究員為論文的共同通訊作者，中國中醫(yī)科學(xué)院黃璐琦院士指導(dǎo)了該工作。

1.https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S1096717625000527

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