β-煙酰胺單核苷酸（NMN）因作為細胞內重要輔酶 NAD+的前體而備受關注。NAD+在能量代謝、DNA 修復和細胞衰老等過程中發揮關鍵作用，而 NMN 作為其直接前體，補充 NMN 已成為提升 NAD+水平的有效策略。

近期，江南大學張顯團隊一項題為“Protein Engineering and Dual-Module Optimization for Efficient NMN Production in E. coli”的研究在線發表于 Journal of Agricultural and Food Chemistry 上，研究人員通過蛋白質工程和雙模塊優化技術，在大腸桿菌中成功實現了 NMN 的高效合成。

研究團隊構建了一個創新的雙模塊反應系統，該系統可以直接利用尿苷和煙酰胺，通過多酶級聯反應來合成 NMN。具體而言，模塊 1 由煙酰胺核苷激酶（NRK）與 ATP 再生系統構成，它能夠催化煙酰胺核苷（NR）合成 NMN，同時利用多聚磷酸實現 ATP 的再生，有效解決了酶促磷酸化過程中 ATP 大量消耗的問題；模塊 2 則引入了嘧啶核苷磷酸化酶（PyNP），在 NRK 的協同催化作用下，以尿苷和煙酰胺合成 NMN。這兩個模塊緊密配合，形成了一條 NMN 的高效合成路徑。

圖 | 雙模塊反應系統中，從尿苷到 NMN 的兩步酶促反應路徑

其中，NRK 在整個反應系統中具有雙重功能，既參與 NR 的磷酸化過程生成 NMN，又在 NR 的合成中發揮作用，但 NRK 穩定性較差，不利于反應持續進行，因此研究人員對 NRK 進行了進一步的改造。

通過運用蛋白質工程策略，并借助計算機輔助設計，研究人員對 NRK 進行了半理性設計改造。他們先通過分析蛋白質結構和進化保守性，篩選出 25 個潛在的突變位點。隨后使用 FoldX 軟件對這些位點進行虛擬飽和誘變。經過多輪篩選，最終獲得穩定性提高近 4 倍的突變體 KlmNRKM4。

圖|突變體 KlmNRK 顯著優于野生型

數據表明，突變體 KlmNRKM4 在熱穩定性和催化性能上有顯著提升。與野生型相比，KlmNRKM4 的半衰期增加近 4 倍，在 50℃ 下處理 20 分鐘后，仍能保持 83.5% 的相對活性；其催化效率也提高了 1.2 倍，對 NR 的親和力也得到增強，有助于后續反應高效運行。通過分子動力學模擬和結構分析，研究人員進揭示了 KlmNRKM4 性能提升的內在機制，即突變位點（N90L/S155K/S205P）可以通過增強氫鍵網絡、疏水相互作用以及局部剛性結構，有效穩定酶的動態構象。

除了對關鍵酶 NRK 進行改造，研究人員還對大腸桿菌的底盤細胞進行了優化。在大腸桿菌的內源性 NAD 循環過程中，存在一些代謝途徑將產物 NMN 和底物 NR 轉化為副產物，這極大地降低了 NMN 的產量。為解決這一問題，研究人員利用 CRISPR/Cas9 基因編輯技術，敲除了 pncC、deoD、ushA 和 nadR 等相關基因。實驗結果表明，隨著敲除基因數量的增加，NR 的消耗速率在 6 小時后從 25.8% 顯著降至 7.1%，NMN 的積累效率得到了明顯提高。而當在敲除 4 個基因的大腸桿菌中過表達 pRSFduet-KlmNRKM4-Chppk 構建 NMN3 時，以 400 mM NR 為底物，NMN 的轉化率高達 96%。

圖 | 敲除 pncC 等基因后，NMN 積累效率得到了明顯提高

此外，研究人員還對雙模塊的反應條件進行了全面優化。在模塊 2 中，溫度、pH 值、底盤細胞以及酶比例等因素都會對 NR 的產量產生影響。實驗發現，45℃ 時 NR 產量最高；pH 值在 7-8 之間時，NR 產量達到峰值；敲除編碼磷酸核糖基轉移酶的 deoB 基因后，NR 產量進一步增加；當基于粗酶活性的酶比例（BsPynP:KlmNRKM4）為 1:2 時，NR 產量可提高到 72.5%。最終，研究人員將經過一系列優化后的模塊 2 與模塊 1 相結合，再次以尿苷為底物進行一鍋法合成 NMN，在 300 mM 尿苷的條件下，NMN 的摩爾轉化率達到 81.1%，成功實現了 NMN 的高效生物合成。

總之，這項研究整合了蛋白質工程、代謝工程和多酶級聯策略，構建了高效經濟的雙模塊系統。與傳統合成方法相比，該系統擺脫了對昂貴底物 NR 的依賴，有效解決了 ATP 消耗高、酶穩定性不足以及宿主代謝干擾等關鍵問題，為 NMN 的工業化生產奠定了堅實基礎。

參考文獻：

1.https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.jafc.5c00043

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