母乳中的 α-乳清蛋白（α-LA）是嬰兒生長發育的關鍵營養來源，但其大規模生產長期依賴動物提取，存在過敏風險且與人類蛋白差異顯著。近年來，微生物合成技術為解決這一難題提供了新思路，然而常用宿主畢赤酵母的傳統甲醇誘導系統存在毒性高、工藝復雜等瓶頸。

近日，江南大學劉延峰團隊通過創新代謝工程策略，首次在畢赤酵母中構建了高效、安全的乙醇誘導系統，成功實現人源 α-LA 的無甲醇生產。這項研究成果以“Ethanol-Inducible Bioproduction of Human α-Lactalbumin in Komagataella phaffii”為題發表在 Journal of Agricultural and Food Chemistry 上，搖瓶發酵產量達 16.52 mg/L，3 L 生物反應器擴大后進一步提升至 0.6 g/L，為工業化應用鋪平道路。

傳統畢赤酵母系統中，甲醇既是碳源也是誘導劑，但其毒性會抑制細胞生長，甚至導致蛋白錯誤折疊。針對這一痛點，研究團隊借鑒合成生物學工具，設計了乙醇誘導轉錄信號放大裝置（ESAD）的基因線路。該系統由兩部分組成：一是由乙醇激活的“感應開關”——ICL1 啟動子，用于控制融合蛋白 LacI-Mit1AD 的表達；二是經過改造的“執行元件”——包含多拷貝 lacO 序列的 AOX1 核心啟動子，直接驅動 α-LA 基因表達。當乙醇存在時，ICL1 啟動子啟動，LacI-Mit1AD 蛋白精準結合 lacO 位點，使得 AOX1 核心啟動子啟動轉錄。通過逐步增加 lacO 拷貝數，團隊發現含 5 個 lacO 的菌株（ESAD-5LA）產量達 10.20 mg/L，較單拷貝菌株提升 38%，且細胞在乙醇環境中的生長速度顯著優于甲醇體系，OD600 值高出 20% 以上。這一突破不僅擺脫了甲醇依賴，還意外發現乙醇代謝能為細胞提供更高能量，為后續優化埋下伏筆。

圖 | 基于 PAOX1 構建的無甲醇表達系統的構建和性能

蛋白質分泌效率是工業化生產的關鍵。α-LA 需穿過細胞膜進入培養液才能高效回收，而這一過程依賴信號肽的“導航”功能。傳統 α-factor 信號肽雖廣泛使用，但其效率有限。團隊創新性地提出“雜交信號肽”策略，將 14 種不同來源的信號肽進行模塊化拼接，優化 N 端信號識別區與 C 端加工區的組合。例如，將血清白蛋白信號肽的 N 端與 α-factor 的 C 端融合后，新設計的 P4 型信號肽使 α-LA 產量從 10 mg/L 提升至 12.68 mg/L，提升 26.8%。進一步分析發現，P4 型信號肽結構邊界更清晰，能更高效地將 α-LA 引導至分泌途徑，減少蛋白在細胞內的“滯留損耗”。這種“即插即用”的信號肽設計思路，為其他難分泌蛋白的生產提供了通用解決方案。

隨著表達與分泌難題的攻克，團隊開始探索如何通過基因劑量提升產量。在畢赤酵母中，多拷貝整合是常用策略，但基因副本過多會導致細胞“超負荷”。研究顯示，攜帶 3 個 α-LA 基因拷貝的菌株（LA-3C）搖瓶產量達 16.52 mg/L，但當拷貝數增至 7 個時，產量反而暴跌至接近零。這一現象揭示了細胞代謝的“臨界點”：過多基因副本會透支細胞的能量與資源，觸發內質網應激反應，激活蛋白質降解機制。團隊通過熒光定量 PCR 發現，3 拷貝菌株的 α-LA mRNA 水平是單拷貝的 17 倍，但 7 拷貝菌株的 mRNA 雖更高，蛋白產量卻驟降，推測與錯誤折疊蛋白被內質網批量清除有關。這一發現提示，未來可通過同步強化蛋白折疊輔助因子，突破多拷貝瓶頸。

從搖瓶到生物反應器的放大過程中，團隊發現，乙醇代謝產生的乙酸在發酵液中快速堆積，峰值濃度達 134.77 g/L，嚴重抑制細胞活性。為此，團隊引入聚磷酸激酶（SePPK），通過補充六偏磷酸鈉（SHMP）再生 ATP，為乙酸代謝“充電”。同時，將發酵液 pH 調至 3，抑制胞外蛋白酶對 α-LA 的降解。雙管齊下后，乙酸積累被完全消除，目標蛋白產量至 0.6 g/L。

圖 | 高效價多拷貝 α-乳白蛋白生產菌株的篩選及 3 L 生物反應器中的補料分批發酵

這項研究不僅首次在畢赤酵母中實現了 α-LA 的無甲醇生產，更通過多維度創新將產量提升至工業化潛力水平。與傳統甲醇系統相比，乙醇誘導的工藝安全性更高、能耗更低，且 0.6 g/L 的生物反應器產量較此前報道的甲醇體系（113.4 mg/L）提升超 5 倍。團隊表示，未來將進一步解析畢赤酵母的蛋白酶網絡，通過基因編輯減少蛋白降解，推動這一綠色生產技術從實驗室邁向嬰兒配方奶粉與醫療產品的生產線。

1.Wang X, Zhang X, Mao Y, et al. Ethanol-inducible bioproduction of human α-lactalbumin in Komagataella phaffii[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2025.

免責聲明：本文旨在傳遞合成生物學最新訊息，不代表平臺立場，不構成任何投資意見和建議，以官方/公司公告為準。本文也不是治療方案推薦，如需獲得治療方案指導，請前往正規醫院就診。