“Nucleolin–RNA interaction modulates rotavirus replication”于2024年2月發表在《Journal of Virology》期刊，該研究顯示輪狀病毒的復制受到核仁素的負調控，其調控方式是通過核仁素與病毒 RNA 上 G4 結構的序列直接相互作用來實現的。

病毒依賴細胞蛋白來完成其復制周期。就輪狀病毒而言，在其復制周期中細胞 RNA 結合蛋白所起的作用，是一個尚未得到充分研究的領域。在這項研究中，作者首次證實了核仁素與恒河猴輪狀病毒（RRV）的病毒 RNA 之間存在相互作用。核仁素是一種細胞蛋白，它在核糖體 rRNA 的代謝和核糖體生物發生過程中發揮作用，而它似乎對恒河猴輪狀病毒（RRV）的病毒顆粒數量和病毒 RNA 拷貝數具有調控作用。作者的研究為當前的輪狀病毒復制模型增添了一個新的要素，即細胞蛋白可以對輪狀病毒的復制起到負調控作用。輪狀病毒引發的腸胃炎給全球健康帶來了沉重負擔，尤其是對 5 歲以下的兒童影響很大。輪狀病毒是呼腸孤病毒科（Sedoreoviridae）的成員，屬于無包膜病毒，其特征是擁有一個三層的蛋白質衣殼。它們的基因組由 11 個雙鏈 RNA（dsRNA）片段組成，這些片段編碼六種病毒結構蛋白（VP1、VP2、VP3、VP4、VP6 和 VP7）以及六種非結構蛋白（NSP1、NSP2、NSP3、NSP4、NSP5 和 NSP6）。在感染過程中，輪狀病毒采用復雜的策略，通過調節細胞環境并劫持宿主蛋白來翻譯病毒蛋白和復制其基因組。

核仁素（Ncl）是一種真核生物的磷蛋白，主要存在于細胞核中，其中心區域具有一個 RNA 結合結構域，該結構域包含四個 RNA 識別基序，能夠與 RNA 分子相互作用。這種蛋白在核糖體組裝、rDNA 轉錄以及前體 rRNA 的修飾和加工過程中發揮著多種作用。據報道，核仁素參與了幾種 RNA 病毒與細胞的結合和進入過程，從而影響了這些病毒的初始感染過程此外，它還與杯狀病毒的病毒復制和翻譯以及登革熱病毒顆粒的組裝有關。

為了進一步明確具有 RNA 結合能力的細胞蛋白在輪狀病毒復制過程中所起的作用，作者評估了核仁素（一種已知能與多種 RNA 病毒相互作用的 RNA 結合蛋白）在輪狀病毒復制周期中的作用。為此，作者評估了通過 RNA 干擾（RNAi）技術沉默核仁素表達，對單個復制周期內有感染性的輪狀病毒子代產量的影響。在這些實驗中，將接種在 48 孔板中的 MA104 細胞用一組特異性靶向核仁素的 siRNA 進行轉染，轉染 72 小時后，用四種不同的輪狀病毒毒株感染這些細胞，分別是恒河猴輪狀病毒（RRV）、猿猴輪狀病毒 SA11（SA11）、牛輪狀病毒（UK）和 人輪狀病毒毒株（Wa），感染復數（MOI）為 3。在感染后 15 小時（hpi），收獲被感染的細胞，并通過噬斑形成試驗測定在這些條件下產生的病毒的病毒滴度（圖1A）。

作者發現，與轉染了非靶向對照（NT）siRNA 的細胞相比，從核仁素被沉默的細胞中獲得的四種輪狀病毒毒株的病毒滴度均有所增加。每種毒株的增加倍數分別為：恒河猴輪狀病毒（RRV）6.3 倍，猿猴輪狀病毒 SA11（SA11）4.8 倍，牛輪狀病毒（UK）3.3 倍，Wa 輪狀病毒毒株（Wa）2.4 倍（圖1A）。這一觀察結果表明，核仁素對這四種不同毒株的輪狀病毒感染均起到負調控作用。通過用抗核仁素抗體進行蛋白質免疫印跡，并使用抗波形蛋白抗體（波形蛋白）對上樣對照進行標準化后，通過光密度測定法評估得出，核仁素的敲低效率為 91%（圖1B）。在所研究的條件下，通過乳酸脫氫酶（LDH）釋放試驗測定，用靶向核仁素的 siRNA 處理的細胞中未檢測到明顯的細胞活力變化（圖1C）。

圖1 核仁素表達的敲低促使RRV、SA11、UK 和 Wa 株輪狀病毒的滴度增加。（A）在 48 孔板中培養的 MA104 細胞，用非靶向（NT）siRNA 或核仁素 siRNA 進行轉染。在轉染后 72 小時（hpt），細胞以感染復數（MOI）為 3 的 RRV、SA11、UK 和 Wa 型輪狀病毒進行感染，并在感染后 15 小時收獲細胞。所示數據為三個獨立實驗的算術平均值 ± 標準差。（B）用指定的 siRNA 轉染的細胞在轉染后 72 小時收獲，通過免疫印跡分析檢測蛋白質，使用針對核仁素（Ncl）的抗體，并以波形蛋白（Vim）抗體作為上樣對照。使用 ImageJ 軟件對蛋白質免疫印跡中 Ncl 和 Vim 條帶進行光密度分析。（C）按照制造商的說明，使用乳酸脫氫酶（LDH）釋放測定法評估細胞活力。顯示的是三個獨立實驗的算術平均值 ± 標準差。

為了確定病毒復制周期中受核仁素敲低影響的階段，作者評估了病毒復制的初始階段。為此，用核仁素或非靶向（NT）小干擾RNA（siRNA）預先處理過的MA104細胞，以0.02的感染復數（MOI）感染恒河猴輪狀病毒（RRV）。將細胞固定，然后使用輪狀病毒顆粒的兔多克隆抗體（抗全病毒顆粒抗體，anti-TLPs），通過空斑形成試驗對感染細胞的數量進行定量。在核仁素沉默的細胞和NT對照細胞中測得的病毒滴度在兩組之間沒有統計學上的顯著差異（圖2A），這表明核仁素的減少不會影響病毒進入細胞。 為了評估核仁素對形成中間衣殼和外衣殼的病毒結構蛋白合成的影響，作者通過對敲低核仁素的細胞裂解液中三種病毒結構蛋白（VP4、VP6和VP7）的豐度進行光密度測定分析，來分析病毒蛋白的含量。將MA104細胞轉染核仁素siRNA，然后在轉染后72小時以感染復數為3的輪狀病毒RRV進行感染。在感染后15小時收獲細胞，用抗TLP多克隆抗體通過十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）免疫印跡法分析感染細胞的裂解液。在對照NT siRNA處理的細胞和核仁素沉默的細胞之間沒有觀察到統計學上的顯著差異（圖2B和C）。這些結果證實，在核仁素表達降低的情況下，輪狀病毒結構蛋白的表達量不受影響。

圖2 核仁素低表達對輪狀病毒感染性或病毒蛋白合成沒有影響。（A）如前所述，在96孔板中培養的MA104細胞用非靶向（NT）或核仁素（Ncl）siRNA進行轉染。隨后，細胞以感染復數（MOI）為0.02的恒河猴輪狀病毒（RRV）進行感染，并按照“材料與方法”部分所述，在感染后15小時通過病灶形成試驗測定病毒滴度。將轉染了非靶向siRNA的感染細胞數量視為100%的感染性。（B）MA104細胞用非靶向或核仁素siRNA進行轉染，然后以感染復數（MOI）為3的RRV進行感染。在感染后15小時，收獲細胞，并通過免疫印跡分析檢測蛋白質。該分析使用了一種能識別輪狀病毒結構蛋白（TLPs）的多克隆抗體、一種用于驗證干擾效果的抗核仁素（Ncl）抗體，以及一種波形蛋白（Vim）抗體作為上樣對照。（C）使用ImageJ軟件對從（B）中所示的蛋白質免疫印跡獲得的三種輪狀病毒結構蛋白（VP4、VP6和VP7）和波形蛋白（Vim）進行光密度分析。給出的是三個獨立實驗的算術平均值±標準差。

在輪狀病毒感染期間，負義RNA的合成是衡量基因組復制的一個指標，因為這是合成感染性子代病毒中的基因組雙鏈RNA的一個必要步驟。為了量化先前用核仁素siRNA處理過的、被恒河猴輪狀病毒（RRV）感染的細胞中基因組RNA的合成情況，通過逆轉錄定量聚合酶鏈式反應（RT-qPCR）擴增輪狀病毒S10基因負鏈的特定豐度作為一個指標。為此，以感染復數（MOI）為3的RRV對核仁素被敲低的MA104細胞進行感染，并從在感染后0小時、4小時、8小時和12小時收集的樣本中提取總RNA。數據以倍數增加的形式表示，并且如先前報道所述，將用非靶向（NT）siRNA轉染的細胞在感染后12小時產生的RNA量作為倍數變化的一個單位。 為了定量S10基因負鏈和正鏈的數量，作者使用了一條用于定量PCR分析的標準曲線，該標準曲線基于一個含有RRV S10基因片段互補DNA（cDNA）的質粒構建體（見材料與方法）。在核仁素表達被沉默的條件下，病毒負鏈的合成從感染后4小時開始增加，一直持續到感染后12小時，與用非靶向siRNA處理的對照細胞中觀察到的RNA合成相比，顯著增加了5.8倍（圖3A）。 作者還測定了S10基因正鏈的豐度，它代表了雙鏈RNA基因組合成以及從轉錄過程中合成的信使RNA（mRNA）的總和。與作者在S10基因負鏈中觀察到的情況類似，與對照沉默細胞相比，在感染后8小時觀察到S10 RNA正鏈豐度增加，在感染后12小時顯著增強了3.5倍（圖3B）。這些發現支持了這樣一種觀點，即在核仁素表達被沉默的條件下，病毒RNA合成增加，這促成了所觀察到的子代病毒產生量的增加。

圖3 在核仁素沉默的細胞中，病毒RNA負鏈和正鏈的合成得到增強（A）S10基因負鏈水平和（B）S10基因正鏈水平。給出的是三個獨立實驗的算術平均值±標準差。

為了證明核仁素與輪狀病毒RNA之間存在潛在的相互作用，作者進行了免疫沉淀（IP）實驗。在該實驗中，使用了一種針對核仁素的單克隆抗體對受感染或模擬感染（未感染病毒）的細胞裂解物進行免疫沉淀。通過逆轉錄聚合酶鏈式反應（RT-PCR）擴增輪狀病毒的1、4和10號RNA片段，來檢測免疫沉淀復合物中輪狀病毒RNA的存在情況。作為陽性對照，使用了針對病毒非結構蛋白NSP3的抗體進行免疫沉淀，因為已知這種蛋白能特異性地結合所有輪狀病毒RNA片段。此外，作為陰性對照，使用了針對蛋白磷酸酶1（PP1）的抗體，此前已證明該抗體不與輪狀病毒RNA相互作用。 通過使用針對核仁素、NSP3和PP1的特異性抗體對沉淀物進行蛋白質免疫印跡（western blot）分析，驗證了免疫沉淀實驗的有效性（圖4A）。當使用核仁素單克隆抗體對細胞裂解物中可能存在的蛋白質-RNA復合物進行免疫沉淀時，從受感染細胞中獲得了一條751堿基對的RT-PCR擴增產物，該產物對應于輪狀病毒的S10片段（圖4C）。當使用針對NSP3的多克隆抗體進行免疫沉淀時，也檢測到了這條擴增產物。重要的是，使用PP1抗體時未觀察到擴增條帶。為了證實病毒感染期間輪狀病毒的其他片段也能與核仁素結合，進行了額外的免疫沉淀實驗。且使用了多對引物來擴增恒河猴輪狀病毒（RRV）的三個不同片段，即1號片段（S1）、4號片段（S4）和10號片段（S10）。使用特異性抗體對沉淀物中核仁素、NSP3和PP1的存在情況進行了驗證（圖4B）。通過逆轉錄定量聚合酶鏈式反應（RT-qPCR），作者證實了對應于S1、S4和S10的三個不同輪狀病毒片段的存在（圖4D）。綜上所述，這些結果為核仁素與恒河猴輪狀病毒（RRV）mRNA的三個不同片段之間存在特異性相互作用提供了證據。

圖4 核仁素在輪狀病毒感染的細胞中與病毒RNA結合（A）添加或不添加抗體進行免疫沉淀（IP）所檢測到的蛋白質的可視化結果。（B）input中的蛋白質以及用于RNA檢測的免疫沉淀樣品中所檢測到的蛋白質的可視化結果。（C）用TRIzol提取每個免疫沉淀樣品中存在的RNA，并通過end-point RT-PCR擴增恒河猴輪狀病毒（RRV）的第10片段。擴增產物在1%的瓊脂糖凝膠中進行分離。以輪狀病毒的RNA作為模板作為反應的陽性對照（+C），以水作為反應的陰性對照（-C）。（D）使用逆轉錄定量聚合酶鏈式反應（RT-qPCR）鑒定與S1、S4和S10對應的RNA，并描繪出相對于標準曲線的RNA拷貝數。所展示的數據為三個獨立實驗的算術平均值±標準差。

為了確定核仁素與輪狀病毒S10 RNA的結合是否是因為與已鑒定的G-四鏈體（G4）結構域的相互作用所介導的，將MA104細胞轉染了陽性對照物AGRO100，這是一種已知能形成G-四鏈體結構并特異性結合核仁素RNA結合結構域的寡核苷酸。作為陰性對照，將細胞轉染了CRO26，這是一種與AGRO100序列相同的寡核苷酸，其中的鳥嘌呤被胞嘧啶所取代。如“材料與方法”部分詳細所述，在轉染前對這些序列進行了體外折疊處理。在這些實驗中，先前已轉染了上述任一寡核苷酸的MA104細胞以感染復數（MOI）為3的恒河猴輪狀病毒（RRV）進行感染。在感染后15小時，收集被感染的細胞，并按照先前描述的方法測定子代病毒的產生情況。作者發現，與轉染了CRO26的對照細胞相比，轉染了AGRO100的細胞中病毒產量增加了1.5倍（圖5A）。這一發現表明，核仁素的RNA結合基序參與了對輪狀病毒感染性顆粒產生的調控。為了確定在輪狀病毒基因組中預測的G-四鏈體結構是否能模擬AGRO100的作用，作者合成了在RNA S10中鑒定出的三個G4序列（G4-1、G4-2和G4-3）。對這些序列進行體外折疊處理后，將它們分別轉染到MA104細胞中，以評估它們對病毒產量的影響。值得注意的是，與對照寡核苷酸（CRO26）相比，用寡核苷酸G4-1和G4-3處理的RRV感染細胞顯示出病毒產量顯著增加，分別增加了1.6倍和2.1倍。相比之下，與對照組相比，寡核苷酸G4-2對病毒產量沒有顯著影響（圖5B）。作為額外的對照，在體外折疊處理前轉染了寡核苷酸G4-3（未折疊的G4-3，UnG4-3）。該實驗結果表明，與陰性對照CRO26相比，病毒滴度沒有變化，這表明G4結構的折疊對于影響病毒的復制是必要的（圖5C）。最后，為了排除所觀察到的感染性病毒產量增加可能是由于RRV的G-四鏈體區域與其他細胞蛋白的非特異性相互作用所導致的這種可能性，并確定病毒產量增加與RRV的G4序列和核仁素的結合之間的直接關聯，通過RNA干擾（RNAi）使MA104細胞中核仁素蛋白的表達沉默。在轉染后24小時，隨后將細胞用折疊后的G4-3寡核苷酸轉染48小時。在這段時間之后，用RRV感染細胞，并在37攝氏度下培養，于感染后15小時 。對感染性子代病毒的定量分析顯示，在核仁素沉默的細胞中測得的病毒滴度與另外轉染了RRV G4-3的細胞相比，沒有統計學上的顯著差異（圖5D）。 這些結果表明，G-四鏈體結構通過阻斷核仁素的RNA結合結構域，有利于輪狀病毒RNA的復制。此外，這些結果還表明，在RRV的S10中發現的特定G-四鏈體序列（G4-1和G4-3）可能是核仁素的結合位點，而這種相互作用可能是細胞的抗病毒反應之一。

圖5 具有預測 G4 結構的寡核苷酸對輪狀病毒子代產生的影響。（A）CRO26 和 AGRO100。（B）存在于 RRV S10 中的三個不同的假定 G4 區域的序列：G4-1（116–132 核苷酸（nt））、G4-2（572–607 核苷酸）和 G4-3（717–737 核苷酸）。（C）CRO26、未折疊的 G4-3 序列（UnG4-3）和折疊后的 G4-3。（D）在 48 孔板中培養的 MA104 細胞用核仁素 siRNA 使其基因沉默。在沉默 24 小時后，用輪狀病毒 G4-3 寡核苷酸（Ncl+G4-3）轉染細胞。在轉染 48 小時后，細胞以感染復數（MOI）為 3 的 RRV 進行感染。在感染后 15 小時，裂解細胞，并通過病灶形成試驗測定細胞裂解物中的病毒滴度。所展示的數據為三個獨立實驗的算術平均值 ± 標準差。

這項研究強調了核仁素在輪狀病毒感染過程中的重要性，它通過負向調節病毒RNA的合成以及感染性病毒的產生來發揮作用。當在 MA104 細胞中敲低核仁素的表達時，病毒 RNA（vRNA）的拷貝數和病毒子代的數量都會增加。免疫沉淀實驗表明，核仁素有可能通過與輪狀病毒 RNA 上的 G -四鏈體 RNA 結構結合來與之相互作用。此外，作者使用了預測能夠形成 G -四鏈體結構、并且模擬輪狀病毒基因片段 10 中序列的合成序列，證實了這些區域會阻礙核仁素的結合，從而導致有感染性的病毒顆粒的產生增加。這篇研究對探索具有RNA結合結構域的蛋白質在RNA病毒感染中具有重要意義。

原文鏈接：https://journals.asm.org/doi/10.1128/jvi.01677-23?url_ver=Z39.88-2003&rfr_id=ori:rid:crossref.org&rfr_dat=cr_pub++0pubmed

來源：哈獸牛羊病之家

本期編輯：吃一口小貓