世界衛生組織（WHO）已批準多種COVID-19疫苗用于緊急使用，這些疫苗基于多種平臺，例如mRNA疫苗、滅活病毒疫苗、蛋白亞單位疫苗和腺病毒載體疫苗。大多數疫苗選擇S蛋白或其RBD結構域作為免疫原，以刺激機體產生適應性免疫并建立長期免疫記憶。Ad5-nCoV（"克威莎"疫苗）是一種腺病毒載體疫苗，由軍事科學院軍事醫學研究院陳薇院士團隊及康希諾生物聯合研發，已在十多個國家獲批，并在COVID-19大流行期間向全球供應了超過1億劑。2022年底，霧化吸入型Ad5-nCoV也在中國獲批緊急使用，作為加強疫苗顯示出良好的免疫原性，并在真實世界中證明了其預防感染的有效性。盡管Ad5-nCoV疫苗在臨床試驗中表現出良好的保護效果，但其高免疫原性和發揮作用的分子機制尚未完全闡明。

2025年3月19日，生命學院李賽課題組在《Structure》期刊發表了題為“Molecular basis of Ad5-nCoV vaccine-induced immunogenicity”的研究論文。該研究通過冷凍電子斷層掃描（cryo-ET）、熒光顯微鏡和質譜分析等技術，首次在分子層面揭示了兩種Ad5-nCoV疫苗誘導的S蛋白的結構、分布和糖基化修飾信息。研究還在細胞水平上進行了功能驗證，為疫苗的優化和開發提供了重要的分子視角。

本項目研究了兩種疫苗，分別編碼了野生型新冠病毒S蛋白（Ad5-nCoV_Wu）和Omicron變異株+序列優化的S蛋白（Ad5-nCoV_O）。研究團隊首先對Ad5-nCoV疫苗接種細胞后誘導的S蛋白進行了免疫熒光染色，對Ad5-nCoV腺病毒疫苗表達的S蛋白在細胞上的具體定位進行分析，確認了Ad5-nCoV疫苗誘導產生的S蛋白表達在細胞膜上。接著使用冷凍電子斷層成像（cryo-ET）技術對接種疫苗后的細胞進行原位研究，在原位水平上觀察到Ad5-nCoV疫苗誘導的S蛋白密集地呈現在細胞膜上，并且主要以融合前構象（prefusion）存在。研究團隊還觀察到，接種Ad5-nCoV疫苗的細胞能分泌出由S蛋白包被的囊泡。原位cryo-ET捕捉到了S蛋白包被囊泡的分泌過程中分別存在于細胞內部與細胞外部的狀態（圖1）。這些由S蛋白包被的囊泡可以隨著體液運輸擴大免疫范圍。

圖1 Ad5-nCoV疫苗誘導的S蛋白冷凍電子斷層圖像

團隊在細胞水平的研究中發現，Ad5-nCoV_Wu疫苗誘導的S蛋白在細胞膜上能夠介導細胞間融合，形成合胞體，而Ad5-nCoV_O疫苗由于2P突變和S1/S2切割位點的刪除，顯著減少了合胞體的形成，表明這些突變有效穩定了S蛋白的前融合構象，防止了細胞間融合的發生（圖2）。

圖2 Ad5-nCoV疫苗誘導的S蛋白在細胞膜上的分布及合胞體形成

通過子斷層平均（sub-tomogram averaging）方法，團隊解析了S蛋白的原位結構。發現其結構與天然SARS-CoV-2病毒上的S蛋白高度相似，S蛋白結構完整且RBD結構域具有靈活抬起和落下的特性（圖3）。

圖3 Ad5-nCoV疫苗誘導的S蛋白原位結構

為了在原位水平上驗證Ad5-nCoV疫苗誘導的S蛋白的免疫原性，團隊使用特異性識別S蛋白的抗體對接種Ad5-nCoV_O疫苗的細胞進行孵育并進行免疫熒光觀察及cryo-ET數據收集。在原位上發現Ad5-nCoV疫苗誘導的S蛋白可以被抗體識別并結合，具有良好的免疫原性（圖4）。

圖4 Ad5-nCoV疫苗誘導的S蛋白的免疫原性驗證。斷層圖像中紅色標注為細胞表面的S蛋白密度，藍色標注為識別S蛋白的抗體密度。

此外，團隊通過質譜分析，詳細解析了Ad5-nCoV疫苗誘導的S蛋白的糖基化修飾。研究發現，Ad5-nCoV疫苗誘導的S蛋白的糖基化模式與天然SARS-CoV-2病毒上的S蛋白高度相似，尤其是Omicron株S蛋白的糖基化更為成熟，復雜型糖基化比例更高。這些糖基化修飾不僅有助于S蛋白的正確折疊，還可能影響其免疫原性，進而影響疫苗的保護效果（圖5）。

圖5 Ad5-nCoV疫苗誘導的S蛋白的糖基化修飾

本研究通過使用cryo-ET技術，揭示了Ad5-nCoV疫苗誘導的S蛋白的結構特征，發現疫苗能夠高效誘導S蛋白的表達，并且這些S蛋白具有高度的結構完整性和免疫原性。這些發現為理解疫苗如何通過細胞呈遞抗原至細胞膜，并傳遞抗原至體內從而激活免疫系統的過程提供了原位水平的視角。在細胞水平上對Ad5-nCoV疫苗引發的合胞體現象的研究，為疫苗的接種策略優化提供了建議。然而，Ad5-nCoV疫苗誘導的S蛋白的具體免疫機制，尤其是其與中和抗體的結合機制、疫苗誘導的后續免疫反應的分子機制等，是下一步的研究重點。

清華大學生命學院、北京生物結構前沿研究中心、清華-北大生命聯合中心、膜生物學國家重點實驗室李賽副教授為本研究的通訊作者。清華大學生命學院2020級博士研究生董冬陽和博士后宋雨桐為本研究的共同第一作者。另外，李賽課題組2020級博士研究生彭程、2023級博士研究生張偉平、2021級博士研究生孔維正、科研助理張哲源、2023級博士研究生宋靜雯參與了部分工作。軍事科學院軍事醫學研究院研究員侯利華、吳詩坡與副研究員王步森為項目提供了腺病毒載體疫苗和寶貴的科學建議。

本工作得到了國家蛋白質科學研究（北京）設施清華基地冷凍電鏡平臺、生物計算平臺、細胞影像平臺和公共生物安全二級實驗平臺的技術支持。同時，本研究得到了國家自然科學基金、清華大學春風基金、清華大學篤實基金、清華-北大生命聯合中心、北京生物結構前沿研究中心、膜生物學國家重點實驗室等支持。特別感謝雷建林博士、楊帆博士、李曉敏博士在冷凍電鏡數據采集方面提供的幫助；感謝劉冰鈺博士、李靜博士在熒光成像方面提供的幫助；感謝鄧海騰博士、田曉林博士在質譜樣品處理及分析方面提供的幫助。

原文鏈 接 ： https://www.cell.com/structure/fulltext/S0969-2126(25)00062-0

來 源：生命科學前沿

本期編輯：可愛晨