腫瘤患者及家屬對病理報(bào)告應(yīng)該很是熟悉，但是病理報(bào)告是怎么出來的，具體有什么用，還不是很清楚。

今天，小編就跟大家深度講一講病理診斷。

病理診斷指通過手術(shù)切除、內(nèi)鏡活檢、細(xì)針穿刺等方式獲取人體組織或細(xì)胞，借助顯微鏡等工具對樣本進(jìn)行一系列處理和觀察，研究疾病病因、發(fā)病機(jī)制、形態(tài)結(jié)構(gòu)、功能和代謝等方面的改變，揭示疾病的發(fā)生發(fā)展規(guī)律，從而闡明疾病本質(zhì)的醫(yī)學(xué)科學(xué)，是絕大部分疾病，尤其是腫瘤疾病的診斷“金標(biāo)準(zhǔn)”。

病理診斷流程主要包含取樣、制片、診斷、報(bào)告四個(gè)步驟。

根據(jù)樣本類型可分為組織學(xué)檢查、細(xì)胞學(xué)檢查兩類。

二者取樣方式并不相同，組織學(xué)樣本一般通過開放手術(shù)、內(nèi)鏡檢查或經(jīng)皮穿刺活檢獲取，而細(xì)胞學(xué)樣本一般通過體液、拉網(wǎng)、細(xì)針穿刺、脫落細(xì)胞等途徑獲取。

組織學(xué)檢查和細(xì)胞學(xué)檢查是病理診斷的兩類基本方式，通常稱為組織病理和細(xì)胞病理，主要進(jìn)行的是形態(tài)學(xué)觀察。

通過分別與免疫診斷、分子診斷相結(jié)合，病理診斷形成了另外兩個(gè)重要分支：免疫病理和分子病理，將病理診斷從組織、細(xì)胞水平的形態(tài)學(xué)觀察深入到蛋白與分子水平。

一

組織病理

組織學(xué)檢查一般可分為石蠟切片和術(shù)中冰凍切片兩種制片方式，二者應(yīng)用場景不同，各有優(yōu)劣。

• 石蠟切片應(yīng)用最為廣泛，但制片過程較為繁瑣，耗時(shí)較長，一般需要3-5天才能出具結(jié)果，但清晰度較高，并且可以長期保存使用；

• 冰凍切片一般用于手術(shù)中快速診斷，通過低溫將組織快速冷卻硬化，僅需半小時(shí)左右即可 出具診斷結(jié)果，但制片質(zhì)量不如石蠟切片，存在一定誤診率，對病理醫(yī)師要求較高。

根據(jù)2009年《病理科建設(shè)與管理指南（試行》要求，出具一般病理診斷報(bào)告的醫(yī)師需具備初級(jí)以上病理學(xué)專業(yè)技術(shù)職務(wù)任職資格，且經(jīng)過病理診斷專業(yè)知識(shí)培訓(xùn)或?qū)？七M(jìn)修學(xué)習(xí)1-3 年，而快速病理診斷醫(yī)師應(yīng)當(dāng)具有中級(jí)以上病理學(xué)專業(yè)技術(shù)任職資格，并有5年以上病理閱片診斷經(jīng)歷。

HE染色為最常見、最基本的切片染色方法，其中蘇木精染液為堿性，主要使細(xì)胞核內(nèi)的染色質(zhì)與胞質(zhì)內(nèi)的核酸著紫藍(lán)色；伊紅為酸性染料，主要使細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞外基質(zhì)中的成分著紅色 。

二

細(xì)胞病理

目前，細(xì)胞病理常用制片技術(shù)分為巴氏涂片及液基薄層細(xì)胞學(xué)制片技術(shù)。

巴氏涂片法利用刮板從宮頸處刮取脫落細(xì)胞，然后直接在玻片上涂抹，進(jìn)而完成固定、染色。由于巴氏涂片存在細(xì)胞丟失、制片質(zhì)量差等問題，其逐步被液基薄層細(xì)胞學(xué)制片方式替代；液基薄層細(xì)胞學(xué)制片主要可分為膜式制片（ TCT ）、沉降式制片（ LCT/LBP）兩類，一般習(xí)慣統(tǒng)稱為TCT，不做具體區(qū)分。

• TCT：利用將宮頸脫落細(xì)胞洗入細(xì)胞保存液瓶中，刮片毛刷在小瓶內(nèi)攪拌，通過高精密度過濾膜過濾將標(biāo)本中的雜質(zhì)分離，取濾后的上皮細(xì)胞制成直徑為20 mm薄層細(xì)胞于載玻片上，而后進(jìn)行固定、染色、封片。

• LCT/LBP：采用兩次離心及獨(dú)立染色，在自動(dòng)化、標(biāo)準(zhǔn)化等方面具有較大優(yōu)勢，可以實(shí)現(xiàn)對病理診斷質(zhì)量的良好控制，目前已成為我國主流細(xì)胞學(xué)制片方式。除主要應(yīng)用于宮頸細(xì)胞學(xué)檢測以外，在痰、胸腹水、尿液、肺泡灌洗液等非婦科樣本檢測方面更具優(yōu)勢。

三

免疫組化病理

免疫組織化學(xué)（Immunohistochemistry, IHC）指利用抗原與抗體間的特異性結(jié)合原理和標(biāo)記于抗體上的顯色劑（酶、熒光素、同位素、 金屬離子等），對組織內(nèi)特定抗原或抗體進(jìn)行定位、定性或定量檢測。IHC具有特異性強(qiáng)、敏感性高、定位準(zhǔn)確、形態(tài)與功能相結(jié)合等特點(diǎn)，有利于病理學(xué)領(lǐng)域的深入研究，在現(xiàn)代病理診斷中起重要作用。

相關(guān)術(shù)語還包括免疫細(xì)胞化學(xué)（Immunocytochemistry, ICC）和免疫熒光（Immunofluorescence, IF），IHC、ICC指通過標(biāo)記酶進(jìn)行顯色，臨床上一般統(tǒng)稱為IHC，不作嚴(yán)格區(qū)分；

IF利用熒光素而非酶來進(jìn)行顯色，有時(shí)也稱為熒光法IHC。

IF是最早建立的免疫組織學(xué)技術(shù)。將已知抗體標(biāo)上熒光素，以此作為探針，檢查細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原。當(dāng)抗原抗體復(fù)合物中的熒光素受激發(fā)光的照射后會(huì)發(fā)出一定波長的熒光，從而對組織中的抗原進(jìn)行定位或定量，需配合使用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察。

IHC/ICC技術(shù)出現(xiàn)在IF之后，目前在臨床上應(yīng)用最為廣泛。IHC/ICC先以酶標(biāo)抗體作用于組織或細(xì)胞，然后加入底物，在酶的催化下 生成有色的不溶性物質(zhì)，從而對細(xì)胞內(nèi)抗原進(jìn)行定位，只需使用普通光學(xué)顯微鏡即可進(jìn)行觀察。

免疫組化在病理診斷工作中應(yīng)用廣泛，可提供蛋白表達(dá)層面的客觀證據(jù)，在腫瘤良惡性判斷、確定腫瘤細(xì)胞來源、鑒別診斷腫瘤類型或亞型、腫瘤分化方向、腫瘤分級(jí)、預(yù)后判斷、靶向治療、微小轉(zhuǎn)移灶的發(fā)現(xiàn)和確定等方向有廣泛應(yīng)用。

對于感染性疾病，通過免疫組化技術(shù)識(shí)別特定的細(xì)菌、病毒等微生物，提高感染性疾病病理診斷的準(zhǔn)確性。

此外，免疫組化還能用于靶向藥物腫瘤靶標(biāo)的測定、腫瘤化學(xué)性藥物治療反應(yīng)的預(yù)測以及腫瘤預(yù)后判斷的綜合性評(píng)估，達(dá)到和實(shí)現(xiàn)伴隨診斷意義。

免疫組化病理：染色制片過程

1. 烤片：將帶有蠟的組織切片黏在載玻片上，以免染色過程中切片脫落 ；

2. 脫蠟和水化：通過二甲苯進(jìn)行脫蠟，然后使用下行梯度乙醇將組織中二甲苯替代出來 ；

3. 抗原修復(fù)：部分抗原肽鏈經(jīng)過此前步驟處理后發(fā)生扭曲，無法在免疫組化染色過程中顯示，因而需利用化學(xué)試劑或熱作用將被封閉抗原重 新暴露 ；

4. 細(xì)胞膜打孔：使用脂溶性試劑將細(xì)胞膜穿孔，增加細(xì)胞膜對抗體的滲 透性（檢測細(xì)胞膜抗原時(shí)可免去此步驟） ；

5. 滅活內(nèi)源性酶及封閉內(nèi)源性生物素：防止底物H202分解，DAB沉淀 ；

6. 非免疫血清封閉：利用與二抗種屬相同的非免疫血清封閉電荷，阻止一抗與之結(jié)合，抑制非特異性背景著色，防止抗體被組織切片中富有電荷的膠原和結(jié)締組織成分吸附 ；

7. 一抗孵育：按照推薦濃度做梯度稀釋，確定最適濃度 ；

8. 二抗孵育：加入選擇與一抗種屬匹配的二抗進(jìn)行孵育 ；

9. 顯色：滴加顯色劑，一般選用DAB或AEC ；

10. 復(fù)染：使用蘇木精等普通染料對切片進(jìn)行復(fù)染，使切片清晰顯示組織結(jié)構(gòu)，便于準(zhǔn)確定位 ；

11. 封片；

免疫組化病理：檢測及顯色系統(tǒng)

免疫組化染色中使用的抗體主要分為一抗、二抗。

一抗是可與抗原特異性結(jié)合的抗體。一抗種類包括單克隆抗體和多克隆抗體，主要作用在于識(shí)別出試驗(yàn)所需檢測的物質(zhì)；

二抗可與一抗特異性結(jié)合，即抗體的抗體。二抗針對某一 特定物種產(chǎn)生的所有抗體均具有特異性，二抗上通常標(biāo)記 酶、熒光基團(tuán)等物質(zhì)用于后續(xù)顯色或發(fā)光。二抗的作用在 于檢測一抗的存在、放大一抗的信號(hào)。

根據(jù)是否選用二抗以及二抗標(biāo)記物類型可形成多種不同的 檢測系統(tǒng)，目前生物素法以及酶標(biāo)聚合物法使用較為廣泛。

顯色系統(tǒng)：亦包含多種類型，其中HRP-DAB應(yīng)用最為廣 泛。

免疫組化病理：臨床應(yīng)用（以NSCLC為例）

免疫組化技術(shù)廣泛應(yīng)用于各類腫瘤的診斷，以非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）為例，NSCLC占所有肺癌的 80%，可以分為不同的組織學(xué)類型， 主要包括腺癌（≥ 40%）和鱗癌（30%），以及較為少見的大細(xì)胞癌（LCC）（10%）。隨著肺腺癌和鱗癌個(gè)體化治療方案的日趨不同，臨床強(qiáng)烈要求對不同組織學(xué)類型的 NSCLC 進(jìn)行明確診斷。

四

分子病理

分子診斷是應(yīng)用分子生物學(xué)方法，通過檢測受檢個(gè)體或其攜帶病毒、病原體的遺傳物質(zhì)的結(jié)構(gòu)或含量的變化而做出診 斷的技術(shù)，被廣泛應(yīng)用于傳染性疾病、血液篩查、遺傳性疾病、腫瘤伴隨診斷等領(lǐng)域。

分子病理則是將分子診斷技術(shù)應(yīng)用于病理診斷中，以組織學(xué)/細(xì)胞學(xué)標(biāo)本為載體，從基因水平上檢測細(xì)胞和組織的分子遺傳學(xué)變化，以協(xié)助病理診斷和分型、指導(dǎo)靶向治療、預(yù)測治療反應(yīng)及判斷預(yù)后。

目前分子病理技術(shù)路線主要包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）、熒光原位雜交（FISH）以及高通量測序（NGS），不同技 術(shù)路線各有優(yōu)劣，其中PCR與FISH技術(shù)平臺(tái)發(fā)展相對較為成熟。

分子病理：技術(shù)路線——PCR

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）是指在DNA聚合酶催化下，以母鏈DNA為模板，以特定引物為延伸起點(diǎn)，通過變性、退火、延伸等步驟，體外復(fù)制出與母鏈模板DNA互補(bǔ)的子鏈DNA的過程。

自上世紀(jì)80年代問世至今，PCR技術(shù)已經(jīng)迭代至第三代：

• 第一代定性PCR：通過瓊脂糖凝膠電泳對PCR產(chǎn)物進(jìn)行分析，分析僅停留在定性或半定量層面，且檢測時(shí)間長、有交叉感染風(fēng)險(xiǎn)。

• 第二代qPCR（實(shí)時(shí)熒光定量PCR）：在PCR反應(yīng)體系中加入可與DNA產(chǎn)物特異性結(jié)合的熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測整個(gè)PCR進(jìn)程，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線實(shí)現(xiàn)定量分析，數(shù)據(jù)采集可在PCR擴(kuò)增過程中完成。

• 第三代dPCR（數(shù)字PCR）：基于芯片式液滴微流控技術(shù)，將一個(gè)樣本分成幾萬到幾百萬份，分配到不同的反應(yīng)單元，每個(gè)單元包含一個(gè)或多個(gè)拷貝的目標(biāo)分子( DNA 模板) ，在每個(gè)反應(yīng)單元中分別對目標(biāo)分子進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)束后對各個(gè)反應(yīng)單元的熒光信號(hào)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，可以對實(shí)現(xiàn)絕對定量檢測。

分子病理：qPCR技術(shù)延伸-突變擴(kuò)增阻滯系統(tǒng)（ARMS）

ARMS技術(shù)：在反應(yīng)體系內(nèi)加入針對檢測目標(biāo)的“突變型”引物，利用野生型核酸模板不能與“突變型”引物的3’端堿 基互補(bǔ)配對而無法被Taq酶延伸的原理，實(shí)現(xiàn)對野生型核酸模板的擴(kuò)增阻滯。而突變型核酸模板能夠與“突變型”引物 的3’端堿基互補(bǔ)配對，通過PCR反應(yīng)放大“突變”信號(hào)并最終被qPCR儀檢測出來。

利用ARMS技術(shù)合并熒光探針，在實(shí)時(shí)熒光PCR平臺(tái)上對樣本DNA進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)的基因突變檢測，是目前應(yīng)用 最成熟、臨床應(yīng)用最廣泛的技術(shù)平臺(tái)。該技術(shù)優(yōu)點(diǎn)包括：

（1）檢測靈敏度高，可檢測腫瘤細(xì)胞中突變比例為1%甚至更 低的突變基因；

（2）適用于片段化DNA，利于開展分子病理診斷（由于甲醛的固定處理，石蠟包埋標(biāo)本組織的DNA 大部分片段化）；

（3）結(jié)合qPCR實(shí)現(xiàn)閉管操作，可減少污染的可能性。

分子病理：技術(shù)路線——FISH

熒光原位雜交（FISH）是依據(jù)堿基互補(bǔ)原理，應(yīng)用熒光素直接或間接標(biāo)記的核酸探針，在組織切片、細(xì)胞涂片、染色體鋪片上檢測間期細(xì)胞核染色質(zhì)數(shù)量及結(jié)構(gòu)變化，進(jìn)行定性和相對定量的分析檢測技術(shù)。由于DNA分子在染色體上沿縱軸呈線性排列，因此可以使用探針直接與染色體進(jìn)行雜交從而在染色體上定位特定的基因。通過用半抗原標(biāo)記DNA或RNA探針與目標(biāo)序列互補(bǔ)配對，通過帶有熒光基團(tuán)的抗體識(shí)別半抗原進(jìn)行檢測， 或直接用熒光基團(tuán)對探針進(jìn)行標(biāo)記并與目標(biāo)序列結(jié)合，最后利用熒光顯微鏡直接觀察目標(biāo)序列在細(xì)胞核、染色體或切片組織中的分布情況。

優(yōu)點(diǎn)：可多種熒光標(biāo)記，顯示 DNA 片段及基因之間的相對位置與方向，空間定位精確；靈敏、特異性好，可同時(shí)分析分裂期和間期的多個(gè)細(xì)胞，并進(jìn)行定量；可以檢測隱匿或微小的染色體畸變及復(fù)雜核型。

缺點(diǎn)：不能達(dá)到100%雜交，在應(yīng)用較短的cDNA探針時(shí)效率明顯下降；對操作和判讀技術(shù)要求較高；成本昂貴、通量低。

分子病理：技術(shù)路線——NGS

高通量測序（NGS）是繼Sanger 測序的革命性進(jìn)步，指通過模板DNA分子的化學(xué)修飾，將其錨定在納米孔或微載體芯片上，利用堿基互補(bǔ)配對原理，在DNA聚合酶鏈反應(yīng)或DNA連接酶反應(yīng)過程中，通過采集熒光標(biāo)記信號(hào)或化學(xué)反應(yīng)信號(hào)，實(shí)現(xiàn)堿基序列的解讀。

NGS可以進(jìn)行大規(guī)模平行測序，每次運(yùn)行可同時(shí)對數(shù)百萬個(gè)片段進(jìn)行測序，提高速度和精確度，同時(shí)測序成本大幅降低。

以上就是關(guān)于病理診斷技術(shù)基礎(chǔ)的介紹與應(yīng)用。

文章來源：e藥安全

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