卡介苗（BCG）是一種牛分枝桿菌減毒活菌株，是唯一獲批的結核病疫苗。自 1920年代以來，卡介苗已接種超過 40 億劑。卡介苗預防兒童感染結核分枝桿菌的免疫保護效力可達80%以上，然而，在青少年和成人中，其免疫保護效力極其不穩定，變化范圍為 0% 到 80% 之間。目前，大約有 20 億人潛伏感染結核分枝桿菌（LTBI）。卡介苗無法避免潛伏感染的結核分枝桿菌被再次激活，加上缺乏徹底從體內清除結核菌的抗生素以及結核耐藥株不斷涌現，使得結核病的預防和控制變得日益嚴峻。在過去三十年中，人們致力于開發比卡介苗免疫保護效果更佳的結核疫苗，可惜尚未成功。
復旦大學生命科學院張鷺、多倫多大學分子遺傳學系劉軍、上海市公共衛生臨床中心結核病研究中心晏博、斯微生物李航文等人在

Molecular Therapy: Nucleic

Acids

他們開發了一種編碼谷氨酰胺合成酶（GlnA1）和分枝桿菌噬菌體裂解酶LysB融合抗原的L3T mRNA結核分枝桿菌疫苗，以斯微生物開發的TPP作為遞送系統，在斑馬魚結核病模型中表現出顯著的預防和治療活性。

L3T mRNA疫苗免疫斑馬魚使得涉及DNA損傷修復的多個途徑被激活，并且，在肉芽腫中誘導細胞自噬，從而降低斑馬魚體內的細菌負荷，延長生存時間，還表現出一定的殺菌治療效果。總的來說，這項研究表明 mRNA 疫苗可引發有效的先天免疫和適應性免疫，為宿主提供有效的保護來抵御分枝桿菌的攻擊。

01

L3T結核mRNA疫苗的設計構造

谷氨酰胺合成酶（GlnA1）是結核分枝桿菌的必需酶，在氮代謝中發揮核心作用。此外，GlnA1也是結核分枝桿菌的毒力因子及潛在的藥物靶點。LysB是分枝桿菌噬菌體分泌的一種溶菌素，抑制多種分枝桿菌生長，促進裂解，包括結核分枝桿菌（ M. tb ）和海洋分枝桿菌（M. marinum）。研究人員設計結核分枝桿菌mRNA疫苗編碼一種融合抗原：由GlnA1、LysB及兩者之間9個氨基酸組成的Linker構成。經過序列優化的最終mRNA稱為L3T mRNA，其中5'UTR序列來自非洲爪蟾β-珠蛋白基因，而3'UTR序列來自人α珠蛋白基因。L3T mRNA結核疫苗采用斯微生物開發的LPP作為遞送載體。LPP遞送系統通過帶負電的mRNA和帶正電的聚合物混合形成一種致密的核，再包裹脂質雙層形成類似于病毒顆粒樣的核-殼結構。

02

結核L3T mRNA增加先天免疫細胞的募集

疫苗成功接種起始于天然免疫系統的局部激活。肌肉注射后，局部駐留細胞分泌的促炎細胞因子和趨化因子將先天免疫細胞（包括巨噬細胞、中性粒細胞和樹突狀細胞）募集到注射部位。接著，抗原被免疫細胞吸收并運輸到引流淋巴結以激活適應性免疫反應。

研究人員發現，在轉基因斑馬魚幼蟲（其體內的巨噬細胞和中性粒細胞分別表達紅色熒光蛋白和 DsRed）注射3ug L3T mRNA-LPP 4h后，注射部位中性粒細胞和巨噬細胞的募集增加，其中中性粒細胞募集更為明顯，而且，免疫細胞的募集至少要持續至注射后24h。此外，注射3ug L3T mRNA 的斑馬魚幼蟲至少可存活10天。

03

結核疫苗L3T mRNA的免疫保護效果

研究人員使用L3T mRNA-LPP、陰性對照（PBS、LPP及pcDNA）及Ag85A mRNA-LPP（稱為Ag85T）、BCG及L3 DNA疫苗（pcDNA-L3）兩次免疫成年斑馬魚（間隔2周）。第二次免疫后4周，使用M. marinum 535（海分枝桿菌）攻毒。與陰性對照組、編碼Ag85A抗原的mRNA疫苗及編碼相同抗原的DNA疫苗相比，L3TmRNA-LPP顯然擁有更高的生存率。有意思的是，盡管L3T DNA疫苗的免疫劑量（6μg）高于L3T mRNA疫苗的免疫劑量（3μg），但是，L3T mRNA疫苗免疫保護效果更好。

在攻毒試驗后3周，處死疫苗免疫過的斑馬魚，進行細菌負荷和組織學分析。L3TmRNA免疫斑馬魚體內的細菌負荷要比其他免疫組降低約2個log。肉芽腫是結核病病理學的一個標志，代表宿主獲得感染和宿主免疫反應的誘導。雖然肉芽腫通過限制病原體使宿主受益，但它們也是細菌傳播的生態位，最終的結果取決于細菌毒力和宿主免疫之間的相互作用。在未免疫的斑馬魚 （陰性對照組 PBS 、 LPP 和 pcDNA） 中，在肝臟、腎臟、脾臟、腸道和睪丸等多個器官中檢測到大量肉芽腫。這些肉芽腫在大小、壞死中心的外觀和壞死程度上是異質性的。值得注意的是，這些肉芽腫中的許多表現為成簇，表明細菌在同一區域廣泛傳播，隨著細菌擴散到鄰近區域，會出現新的肉芽腫。L3TmRNA疫苗免疫的斑馬魚體內肉芽腫數量較少（＜20個），相反，其他對照組檢測到的肉芽腫數量為20-90個。在壞死性肉芽腫中檢測到大量細菌，尤其是那些有干酪性壞死的肉芽腫。因此，壞死性肉芽腫的數量與細菌負荷大致相關。

L3T 免疫斑馬魚體內的肉芽腫往往是孤立的，而就像在其他組 （PBS、LPP、pcDNA 和 pcDNA-L3） 中觀察到的聚集在一起。有趣的是，L3T和Ag85T免疫組中的一些肉芽腫似乎要健康得多：非壞死性且位置獨立；檢測不到細菌。這說明這項肉芽腫的不可能是由于細菌傳播而新形成的，相反，這些肉芽腫可能已經成功解決了感染并正在恢復。

04

結核疫苗L3T mRNA的治療效果

斑馬魚幼蟲感染海分枝桿菌24后，與陰性對照相比（注射PBS或者LPP），注射L3TmRNA，在第2天和第三天可將細菌負荷分別減少1.9倍和2.7倍，延長存活時間。在成年斑馬魚感染海分枝桿菌的第14天和第17天，分別注射兩次L3TmRNA，使得成年斑馬魚存活時間得到明顯延長，體內細菌負荷減少1個log，肉芽腫數量發生顯著減少。

使用三種不同的海分枝桿菌感染斑馬魚，包括海分枝桿菌1218R，滅活1218菌株(whiB4:Tn) 及耐藥菌株M. marinum 535。與陰性對照組（PBS/LPP）相比，L3TmRNA疫苗注射組，斑馬魚體內細菌負荷明顯減少。讓人感到驚訝的是，L3T mRNA疫苗注射組（感染后注射兩次）與利福平注射組（感染后治療持續一周）體內的細菌負荷接近，這說明L3TmRNA疫苗有著非凡的殺菌效果。有趣的是，利福平與L3T mRNA疫苗無疊加或者協同效應，而且，對于耐藥菌株M.marinum535來說，L3TmRNA疫苗顯示出更強的殺菌效果。

05

結核疫苗L3T mRNA疫苗誘導DNA損傷修復

斑馬魚沒有淋巴結，腎臟臟和脾臟是斑馬魚的主要淋巴器官，負責清除外來物質和有缺陷的血細胞。研究人員從分別注射L3T mRNA 疫苗和LPP的斑馬魚體內分離出腎臟細胞進行RNA-seq分析。結果發現，與LPP對照相比，在L3TmRNA疫苗的斑馬魚中共檢測到302個差異表達基因，包括 111 個上調基因和 191 個下調基因。上調基因很多與DNA損傷修復和復制相關，包括Dna2、Fen1、Msh2、Mcm9、PcnA、Pold3、Pms2、Ssrp1a、Spata18和Yars1。

MSH2和PMS2是DNA錯配修復系統的重要組成部分。PCNA 不僅在錯配識別步驟中起著重要作用，而且在隨后的 DNA 合成中也起著重要作用。Pold3 基因編碼 DNA 聚合酶的 66-kDa 亞基δ并調節其活性。雙鏈斷裂（DSB）對于細胞有害，細胞通過兩條主要途徑—同源重組HR和非同源末端連接NHEJ來修復DSB。MCM9 和 DNA2涉及DSB修復過程。單鏈斷裂（SSB）通常是由 DNA 的氧化損傷產生的，PARP1和Fen1參與此過程。SSRP1a 和 SPT16 形成促進染色質轉錄復合物，它充當組蛋白伴侶，作為染色質修復系統的一部分。SPATA18是一種p53誘導蛋白，可誘導線粒體內的溶酶體樣細胞器，從而有助于線粒體質量控制。

DNA損傷修復對于維持基因組穩定性至關重要。在淋巴細胞發育過程中發生的故意 DNA 斷裂和重排，例如V（D）J重組、類別轉換DNA重組及體細胞超突變，對于產生能夠識別廣泛抗原的多種免疫受體和抗體至關重要。參與DNA斷裂和修復的酶缺乏可導致免疫缺陷，例如，RAG1和RAG2產生 DNA雙鍵斷裂以啟動 V（D）J 重組。RAG1或RAG2缺陷小鼠表現出嚴重的聯合免疫缺陷表型，缺乏成熟的B細胞和T細胞.。此外，缺乏 Psm2 或 Msh2 的小鼠表現刺激有限的 B 細胞庫，并且在免疫紅蛋白重鏈上幾乎沒有體細胞突變，這表明錯配修復系統有助于體細胞超突變，而不是抑制效應。

在L3TmRNA免疫的斑馬魚中觀察到多個DNA修復系統被激活，這表明RNA-seq分析已經捕捉到了適應性免疫正常發育中B細胞親和成熟和T細胞激活過程的快照。與此相對應的是，編碼免疫球蛋白（Igs）或者Ig類似結構域蛋白的基因發生顯著富集。此外，CD44基因同樣在L3T mRNA免疫的斑馬魚中發生上調。斑馬魚的CD44a基因在T細胞受體（TCR）激活后不久上調，并在效應細胞和免疫反應消退后存活成為記憶細胞的細胞上保持表達。

內肽酶在抗原加工過程中起著重要作用。內肽酶通過將蛋白質降解成多肽片段，這些片段可以被進一步加工并與MHC分子結合。在L3TmRNA免疫的斑馬魚中，參與內肽酶抑制劑活性和內肽酶活性負調節的基因顯著下調，表明抗原降解和加工發生顯著增加。

總的來說，這些結果表明L3T mRNA免疫激活了經典的DNA損傷修復過程，促進適應性免疫的誘導，包括抗原特異性抗體和T細胞的產生。

06

結核疫苗L3T mRNA疫苗引發自噬

有研究表明，盡管發生于不同的細胞區室內，DNA損傷修復和自噬可能在機制上相關，例如，錯配修復系統的MSH2和MSH6充當5-氟尿嘧啶誘導的DNA損傷的感受器；堿基切除系統的APN-1和EXO3作用于DNA修復的后續步驟，并激活自噬；SPATA18是一種有助于線粒體質量控制的蛋白質，是激活線粒體自噬所必需的。研究人員觀察到L3T mRNA疫苗免疫斑馬魚MSH2、PMS2、SPATA18和組織蛋白酶S（溶酶體中的一種主要蛋白酶）基因表達水平上升，因此，他們對免疫斑馬魚體內的自噬做更仔細的檢測。

LC3是是一種泛素樣蛋白，在自噬體形成中起關鍵作用。LC3B 是 LC3 的一種同工型，而 p62 經常用作疾病條件下臨床樣本中自噬的標志物。免疫染色在L3T免疫的斑馬魚的肉芽腫中檢測到LC3B的強烈信號。與自噬的促生存作用一致，LC3B 在非壞死性肉芽腫中檢測到最強烈和廣泛（左A），并且僅在壞死性肉芽腫的外周檢測到（左B和C）。有趣的是，甚至在伴有干酪性壞死的肉芽腫中檢測到 LC3B 的陽性染色，盡管水平較低（左D）。重要的是，無論壞死程度如何，對照組（PBS和LPP）中的任何肉芽腫都沒有檢測到LC3B呈陽性（左E和F）。

另外一方面，免疫染色在50%的L3T免疫斑馬魚的肉芽腫中檢測到p62染色呈陽性。在 L3T 免疫的斑馬魚中，具有強 p62 信號的巨噬細胞正在積極吞噬并靶向細菌進行自噬降解（右C，箭頭）。這些巨噬細胞可能在消除入侵病原體方面起關鍵作用。隨著細菌種群的減少，需要表達高水平 p62 的巨噬細胞減少(右D)。并且在已完全清除細菌的肉芽腫中，p62 被降解并且不再檢測到（右E）。在對照組中，即使在含有大量細菌的肉芽腫中，也僅檢測

到p62的微弱和彌漫信號（右F和G）。

在L3T免疫組中，未與細菌直接接觸的巨噬細胞中未檢測到p62信號。這表明 p62 表達的誘導是細菌依賴性的。然而，陰性對照組的肉芽腫中的巨噬細胞雖然接觸細菌，仍然表現出缺乏p62信號，也表明細菌本身不足以驅動 p62 表達，需要通過L3T免疫進行引發。

總的來說，這些結果表明L3T mRNA疫苗成功誘導先天免疫機制和適應性免疫機制，從而有效控制細菌感染。

07

結核疫苗L3T mRNA的治療活性由DNA損傷修復介導

利用RNA-seq 技術分析感染海分枝桿菌后L3T免疫的斑馬魚腎臟細胞，研究人員比較陰性對照組（PBS注射組）和L3T治療組在感染后第14天和第24天的基因表達情況，結果發現，細菌感染引起的免疫反應和炎癥在很大程度上不受隨后的mRNA疫苗治療的影響。

有意思的是，與感染后第14天相比，感染后第24天的陰性對照斑馬魚體內涉及DNA復制和修復的基因中有52個發生下調，僅有2個基因發生上調。相反，L3T治療組中，只有4個基因在DNA復制和修復類別中下調，1個基因上調，表明L3T治療能夠抵消M. marinum感染誘導的DNA復制和修復的下調。

綜上所述，這些數據表明，在疾病自然進展過程中，細菌感染引起的炎癥會誘導DNA損傷。然而，海分枝桿菌抑制了宿主DNA損傷修復和復制系統，這導致了斑馬魚的死亡。相比之下，L3T處理激活了宿主DNA損傷修復和復制系統，并在很大程度上中和了病原體的負面影響，從而延長了斑馬魚的存活時間。

08

結語

這項研究開發的L3T mRNA結核疫苗可誘導巨噬細胞自噬以及 B 細胞和 T 細胞免疫，并顯示出卓越的預防和治療活性，強調了引發先天免疫和適應性免疫以控制分枝桿菌感染的重要性。

胞質溶膠中合成的L3T抗原激活了泛素-蛋白酶體系統（UPS），該系統降解抗原，降解的抗原肽被轉移到內質網，結合MHC I 類進行抗原呈遞。激活的UPS還介導胞質海分枝桿菌泛素化，然后被p62靶向進行自噬降解。支持這一點的是，編碼具有預測的泛素連接酶或轉移酶活性蛋白質的幾個基因在 L3T 免疫斑馬魚中上調，包括含有 RING 結構域的 E3 連接酶 Trim35-7、Rnf26 和 Rnf122。

在淋巴細胞抗原受體基因的組裝和多樣化期間，在V（D）J 重組過程中，包括 B 細胞的免疫紅蛋白重鏈基因和輕鏈 κ 和 λ 基因，以及 TCR-β、-α、-γ 和 -δ 鏈基因，適應性免疫細胞中發生程序化 DNA DSBs和重排。體細胞超突變以極高的速率（每次細胞分裂每個堿基對 ～10-3 個突變）在免疫球蛋白基因的可變區引入非模板化點突變，這個過程驅動親和力成熟，從而導致表達對其同源抗原具有高親和力的免疫球蛋白的 B 細胞擴增。這些刻意的 DNA 斷裂和重排對于正常的淋巴細胞發育至關重要。因此，參與經典DNA修復系統的多個基因（包括錯配修復以及DSB和SSB修復）在L3T mRNA免疫斑馬魚中富集和上調可以認為是成功誘導B細胞和T細胞免疫的證據。

尤其值得關注的是，L3T mRNA疫苗顯示出非常有效的殺菌活性，在感染后注射L3T mRNA疫苗的殺菌效果超過了一線抗生素利福平。據目前所知，以前從未對結核病疫苗描述過這種殺菌效果。一種可能的解釋是 L3T mRNA 編碼的溶血素B有助于細菌殺傷。然而，隨著mRNA轉錄水平迅速下降并在注射后72小時達到背景水平， 賴素B蛋白在細菌殺傷中的作用受到限制。因此，未來應該聚焦提升L3TmRNA疫苗的穩定性和豐度，嘗試采用circRNA或者saRNA疫苗平臺，加強其殺菌效果。

參考文獻

[1] Chen D, Huang W, Shen L, Zhang J, Pan Z, Zhang C, Tang Y, Zhou Z, Tao J, Luo G, Zhang S, Zhou J, Xu S, Zhang M, Li Y, Fang Y, Zhao F, Huang L, Li H, Yang H, Lv H, Sha W, Yan B, Liu J, Zhang L. An mRNA vaccine induces antimycobacterial immunity by activating DNA damage repair and autophagy. Mol Ther Nucleic Acids. 2024 Nov 26;36(1):102402. doi: 10.1016/j.omtn.2024.102402.

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撰寫| 工程菌星球

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