四氫嘧啶又稱依克多因（ECT），是一種氨基酸衍生物，對核酸、蛋白、生物膜以及細胞具有修復和保護作用，廣泛應用于化妝品、生物制劑、酶工業和醫療等領域。

近年來，開發高水平生產依克多因的微生物菌株成為備受關注的研究方向。近日，來自中國科學院等離子體物理研究所姚建銘、陳祥松等在 ACS Synthetic Biology 發表題為“Multistep Metabolic Engineering of Escherichia coli for High-Level Ectoine Production”的研究。

天然大腸桿菌缺乏依克多因的合成途徑，因此需要引入外源基因來建立依克多因生產的代謝途徑。首先，通過引入嗜鹽菌 H. elongate 的 ectABC 基因簇，得到重組菌株 HeEct00，ECT 滴度為 0.72 g/L。

圖 | 大腸桿菌中 ECT 的生物合成途徑

ectABC 操縱子編碼了參與 ECT 生物合成最后步驟的三種關鍵酶，這三個基因的協調表達對 ECT 合成至關重要。最初，使用不同的核糖體結合位點 (RBS) 強度來調節這三種酶的表達。然而，與原始菌株相比，這些菌株的 ECT 產量并沒有顯著提高。為了解決這個問題，研究人員調節了 5′-UTR 的強度，設計了不同強度的 5′-UTR 序列來替換 ectA、ectB 和 ectC 的天然 RBS 。結果表明，高 ectB 表達水平顯著促進了 ECT 的積累，HeEct17 產生最高的 ECT 滴度 1.21 g/L。

天冬氨酸 (ASP) 是 ECT 合成中的關鍵前體，而草酰乙酸 (OAA) 是 ASP 的直接前體。因此，增強草酰乙酸的代謝途徑對于 ECT 的生產必不可少。為了增加草酸乙酰的供應，研究人員將編碼大腸桿菌磷酸烯醇丙酮酸羧化酶）的天然啟動子替換為 PT7，并用 PT7 替換丙酮酸羧化酶的天然啟動子，增強丙酮酸到草酰乙酸的積累。結果表明 ECT 的滴度有所增加。為了進一步提高草酰乙酸的積累，編碼檸檬酸合酶（一種關鍵的 TCA 循環酶）的 gltA 被下調，破壞從 OAA 到 TCA 循環的代謝通量。

天冬氨酸可在大腸桿菌中通過 TCA 代謝途徑由 OAA 或延胡索酸生成，天冬氨酸脫氫酶（aspC）和天冬氨酸氨裂解酶（aspA）是 ASP 生物合成途徑中的關鍵酶。為了進一步增加 ASP，將由 PT7 啟動子驅動的 aspC 和 aspA 整合到 HeEct304 基因組中，分別獲得菌株 HeEct310 和 HeEct311。

結果表明，過表達 aspC 的菌株在 55 小時時積累了 2.51 g/L 的 ECT。為了進一步將 OAA 轉向 ASP 生成，來自銅綠假單胞菌的異源基因 aspDH（編碼天冬氨酸脫氫酶）在強 PT7 啟動子下整合到 HeEct310 的基因組中，產生菌株 HeEct312。 最終，該菌株的 ASP 代謝通量增加，但 ECT 滴度與 HeEct310 保持相似。

蘋果酸是草酰乙酸的前體，為了增加蘋果酸的供應，在 HeEct312 中敲除了編碼乙醛酸抑制基因的 iclR ，產生了菌株 HeEct313。得到 2.71 g/L 的 ECT。

由此可見，簡單地上調或下調 TCA 循環對促進 ECT 生物合成沒有顯著的好處。因此，研究人員考慮動態調節 TCA 循環以提高 ECT 生產率。首先，敲除菌株 HeEct313 中的 adhE 基因，這種缺失可以提高 ECT 滴度。在此基礎上，用不同啟動子替換原有 gltA 啟動子。發現 EctRE03 菌株中 ECT 積累最快，54 h 時 ECT 滴度達到 3.11 g/L，表明啟動子 PfliC可提高 ECT 產量。

大腸桿菌中天冬氨酸轉化為 ECT 涉及五個步驟。第一步由 AK 催化，尤為關鍵。但將 lysC（編碼 AK）引入啟動子 PT7 控制下的 EctRE03 基因組中，得到的工程菌株 EctRE07 的 ECT 滴度并未顯著提高，可能是因為 AK被 l-賴氨酸和 l-蘇氨酸抑制。同時刪除 lysA（它將代謝流從 ASP 引導到 l-賴氨酸），ETC 滴度增加。

前期實驗發現，HeEct309、HeEct313、EctRE09 在搖瓶發酵過程中表現出較高的 SET 值，說明單菌產量較高。為了進一步驗證這 3 株菌株的 ECT 生產特性，在 5 L 生物反應器中進行補料發酵，3 株菌株表現出不同的 ECT 生產特性。

HeEct309 的 ECT 滴度達到 37.1 g/L；HeEct313 的 ECT 滴度達到 53.7 g/L；EctRE09 的 ECT 滴度達到 118.5 g/L。在 3 株菌株中，EctRE09 在相同培養條件下表現出最高的 ECT 產量。這強調了動態調節 gltA 表達，結合 lysA 敲除和 lysC 過表達，在促進高效 ECT 合成方面的有效性。

圖 | HeEct309、HeEct313 和 EctRE09 菌株在 5 L 發酵罐中的表現

總而言之，本研究通過系統代謝工程獲得了高效生產 ECT 的大腸桿菌菌株。通過修改基因簇 ectABC 的 5′-UTR 序列以構建高表達基因簇、非 TCA 循環豐富前體草酰乙酸 (OAA) 和天冬氨酸 (ASP) 庫、動態調節 TCA 循環增加生物量、阻斷副產物途徑以減少碳耗散、過表達關鍵代謝節點表達基因并調節反饋抑制來實現的。

最終，通過多步代謝工程在 EctRE09 中實現了高效的四氫嘧啶生產，ECT 滴度達到 118.5 g/L，凈產量為 246.25 g，高于其他重組大腸桿菌菌株。盡管成功獲得了高產菌株，但該菌株的生物量仍然很低，主要是因為 l-賴氨酸表達下調。未來的工作將集中于細胞生長和 l-賴氨酸生物合成的動態調節，以進一步提高 ECT 的產量。

1.https://pubs.acs.org/doi/full/10.1021/acssynbio.4c00876

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