以下是一位參加《 R 語言21天》打卡學習的果友的朋友圈打卡學習筆記，特別棒！可惜，我們的保留了部分內容。記錄一下！

cBioPortal 基因組學分析庫

提供數據：突變數據（Mutation data）點突變、結構變異數據(Structural Variant data) 基因組改變【倒置/轉位/融合】、拷貝數變異數據（Copy Number Alterations）基因副本數 【擴增/刪除】

突變類型：突變(Mutation）、融合(Fusion)、擴增(Amplification)、深度缺失(Deep Delection)

GEO腫瘤、非腫瘤數據庫

搜索：GSE實驗號

數據下載：

GPL探針【公司不同】探針號回歸gene名

GSM樣本 Expression & Clinical data

附加信息：GDS 網站后臺生成數據

?讀取數據
1??GEOquery包在線讀
2??read.table
3??read.tsv/csv
技巧
gc() 釋放空間
rownames (DF)＜- DF[,1] 探針ID為行名
DF＜- DF[,-1]

?GEO數據清洗

1??log2轉換，處理后幾乎所有值應＜20

2??樣本bar圖，決定標準化，去除差異

3??探針ID轉換為基因名

4??limma::avereps (average replicates)基因表達量取平均值

?GEO差異分析

1??原研究設計：GEO界面Summary，Overall design，Samples確定分組信息

2??model.matrix()，通過啞變量，將多分類變量變為多個二分類變量，便于作為數字輸入統計模型，進行差異比較

3??makeContrast()腫瘤低中高級別的多分類數據，low-control,middle-control,high-control

4??構建線性模型，全部都看→轉換為對比模型，挑出重點→差異分析（經典貝葉斯法）→FDR（假發現率）事后檢驗真假

統計知識

FDR、P值、Bonferroni校正、BH校正

尋寶游戲的規則：想象你和朋友們在一個大海灘上舉行尋寶比賽。海灘上埋藏著很多寶箱，但并非所有的寶箱都是真正的寶藏（一些可能是空的）。你的任務是找出盡可能多的真正寶藏，同時避免浪費時間挖掘空寶箱。

P值：規則設定：每當你挖到一個寶箱，你用一個特制的探測器（實驗）來判斷它是否含有寶藏。探測器會給出一個信號（P值），信號越強，寶箱里有寶藏的可能性越大。

通俗解釋：P值就像是探測器的信號強度。一個低P值（強信號）意味著你很可能找到了真正的寶藏，而高P值（弱信號）則可能意味著挖掘到的寶箱是空的。

Bonferroni校正【嚴格要求】

規則設定：因為海灘上寶箱眾多，為了確保你不會因為興奮而錯誤地判斷空寶箱為寶藏，組織者設定了一個更嚴格的判斷標準。比如，探測器信號必須非常強才認定為真寶藏。

通俗解釋：Bonferroni校正就是提高了發現寶藏的標準。這樣做雖然能減少錯誤地認為空寶箱是寶藏的情況，但同時也可能錯過一些真正的寶藏，因為標準變得過于嚴格了。

BH校正【睜一只眼閉一只眼】

規則設定：比賽組織者意識到Bonferroni的規則太嚴格，可能讓一些真正的寶藏被錯過。所以，他們引入了一個新規則，既要減少錯誤挖掘空寶箱的情況，又要盡量不錯過真正的寶藏。

通俗解釋：BH校正是一種平衡策略，它試圖在避免錯誤地挖掘空寶箱和不錯過真寶藏之間找到一個平衡點。

FDR（假發現率）【事后反省】

規則設定：比賽結束后，組織者會檢查所有被標記為含寶藏的寶箱，計算其中真正含寶藏的寶箱所占的比例，以及錯誤標記的空寶箱比例。

通俗解釋：FDR就是在你所有認為找到的“寶藏”中，錯誤地認為空寶箱是寶藏的比例。一個低FDR意味著你在尋寶時非常準確，而高FDR則意味著你可能過于草率，錯誤地將很多空寶箱認為是真寶藏。

柱狀圖、箱線圖、散點圖、小提琴圖（10^1數量級）
熱圖（10^2數量級）
火山圖（10^3數量級及以上）
差異分析結果：
AveExpr，比較組間絕對值的平均差異值。
LogFC，二的幾次方。
t值，表示基因表達在不同樣本之間差異的大小。
P值，用于判斷差異是否具有統計學上的顯著性。
q值，經過多重檢驗校正后的p值，用于控制假陽性的發生率。
B值，是經過bayes調整后得到的標準差的對數值。

1??互作分析富集分析，有一定內在關系：互作才能富集，富集存在潛在互作

2??Cytoscape從差異進行中進一步選出hub基因，進一步確定研究目標基因

1基于篩選的差異基因，判斷上調或下調基因在GO或KEGG通路的富集情況，即GO/KEGG分析。

2不篩選差異，根據基因表達量或表型相關度排序，判斷基因集是否傾向于落在參考基因集的頂部或底部，從而判斷基因集對表型差異的影響，即GSEA富集分析。

3實驗驗證Co-IP, WB

DNA、RNA和蛋白質以及相應檢測技術的具體科學原理和方法比較

DNA檢測技術

1.PCR（聚合酶鏈反應）：原理：通過特定的酶來快速復制DNA片段，使其數量成倍增加，便于檢測。與其他技術的不同：PCR是用于放大DNA片段以便進一步分析的技術，而其他方法如Southern Blot則用于檢測DNA的存在和大小。

2.Southern Blot：原理：將DNA切割成片段，通過電泳分離，然后轉移到膜上并用特定的探針進行檢測。與其他技術的不同：Southern Blot提供了DNA大小和存在的信息，而PCR主要是為了放大DNA片段。

3. FISH（熒光原位雜交）：原理：使用帶有熒光標記的探針尋找并粘附到染色體上特定的DNA序列，通過顯微鏡觀察。 與其他技術的不同：FISH能夠在細胞中的確切位置顯示DNA序列，而PCR和Southern Blot則不提供位置信息。

RNA檢測技術

1.RT-PCR（逆轉錄聚合酶鏈反應）：原理：首先將RNA逆轉錄成cDNA，然后使用PCR技術進行放大。與其他技術的不同：RT-PCR可以從RNA水平分析基因表達，而傳統PCR直接針對DNA。

2.Northern Blot：原理：與Southern Blot類似，但用于檢測RNA片段的大小和存在。與其他技術的不同：Northern Blot專注于RNA，而不是DNA。

3. Microarray/RNA-seq：原理：Microarray使用預制基因芯片來檢測特定基因的表達水平；RNA-seq使用高通量測序技術來讀取RNA分子序列，提供更全面的基因表達信息。與其他技術的不同：RNA-seq提供了更詳細的數據，可以檢測到未知的表達序列，而Microarray僅限于已知的基因序列。

蛋白檢測技術

1. Western Blot：原理：將蛋白分離并轉移到膜上，使用特定抗體進行檢測。與其他技術的不同：Western Blot主要用于檢測特定蛋白質的大小和存在，而不是定量分析。

2. Immunohistochemistry：原理：在組織切片上用標記有染料的抗體直接檢測特定蛋白的位置和表達水平。與其他技術的不同：Immunohistochemistry提供了蛋白在組織中的空間分布，而Western Blot不提供這種信息。

3. Flow Cytometry：原理：使用激光和特定的抗體標記細胞表面的蛋白質，可以同時對成千上萬個細胞進行分析。與其他技術的不同：Flow Cytometry能夠快速提供單個細胞水平的蛋白表達信息，適合細胞群體的分析。

## 高通量篩選方法：
Microarray：允許同時監測數千個基因的表達情況，是高通量技術的典型代表。
RNA-seq：通過下一代測序技術，可以高通量地測定整個轉錄組的表達水平。
Flow Cytometry：當配置自動化樣品處理時，可以快速地對數千到數百萬細胞進行單細胞分析，因此也屬于高通量技術。
## 低通量的驗證方法：
RT-PCR：雖然可以并行處理多個樣品，但每次分析的基因數量有限，通常用于特定基因表達的定量驗證。
Western Blot：通常用于一次檢測少量的蛋白樣品，適用于特定目標蛋白的表達驗證。
Immunohistochemistry：用于檢測組織切片中特定蛋白的分布，通常是單個樣本的定性分析。

在實驗設計時，通常首先用高通量篩選技術來鑒定潛在的基因或蛋白目標，然后使用低通量的驗證方法來確認篩選結果的準確性。