α-紅沒藥醇是一種天然倍半萜類化合物，因其皮膚愈合、防腐、抗炎和抗菌特性被廣泛應用于化妝品和制藥行業。商業化的 α-紅沒藥醇主要通過蒸餾來自各種植物來源的精油生產，但該方法受到季節波動、凈化成本高和產量低的限制。

隨著合成生物學技術的發展，天然產物的生物合成越來越受到關注。此前，科學家通過異源甲羥戊酸 （MVA）途徑在工程大腸桿菌中實現了 α-紅沒藥醇的生物合成，滴度為 23.4 g/L；江大團隊最近開發了一種粘質沙雷氏菌底盤，α-紅沒藥醇的滴度達到 30.2 g/L。

近日，華東理工大學許建和團隊通過代謝工程改造畢赤酵母，實現了 α-紅沒藥醇的高效生產。通過 MVA 途徑優化、多拷貝整合、NADPH 供應增強和分子伴侶工程改造，在 5 L 補料發酵罐中 α-紅沒藥醇產量達到 32.8 g/L，為高效萜類生物合成提供了新的思路。相關研究以題為“Reprogramming Komagataella phaffii for a Robust Chassis toward Efficient De Novo Biosynthesis of (?)-α-Bisabolol”發表在Journal of Agricultural and Food Chemistry。

此前，有其他研究人員通過在畢赤酵母基因組上過表達了來自釀酒酵母的同源重組（HR）相關基因，得到穩健的細胞工廠 PpHR3。因此，研究人員以 PpHR3 作為初始菌株，分別測試了來自母菊（Mr BBS）和菜薊 (Cc BBS) 的 α-紅沒藥醇合酶的效率，發現菌株 KB-01（表達 Cc BBS）發酵 120 h 后，檢測到 α-紅沒藥醇滴度為 7.25mg/L，比菌株 KB-02 高 64.3%，該菌株被用于后續 α-紅沒藥醇生物合成的優化。

優化 MVA 途徑優化 α-紅沒藥醇生物合成的滴度。在畢赤酵母中，乙酰輔酶 A 通過 MVA 途徑轉向 FPP（法呢基二磷酸），FPP 在 α-紅沒藥醇合酶催化下轉化為 α-紅沒藥醇。已發現提高 MVA 通量是提高萜類化合物生物合成滴度的有效策略。因此，研究人員過表達了所有 MVA 途徑相關基因，并評估它們對 α-紅沒藥醇生物合成滴度的影響。

結果顯示，過表達 3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶 A 還原酶 (HMG1)的菌株KB-05 ，α-紅沒藥醇產率達到 18.8 mg/L。HMG1是位于內質網（ER）的整合膜蛋白，過量表達的完整 HMG1 會引起內質網堆積，有較多報道顯示 N 端膜結合域的截短可使 HMG1 穩定在胞質中，明顯提高萜類化合物的滴度。通過截斷 HMG1（tHMG1），菌株 KB-06 的 α-紅沒藥醇滴度顯著提高，達到 86.0 mg/L。

另外一個過表達 MVA 途徑中的限速酶異戊烯基二磷酸異構酶（IDI）的菌株 KB-10，α-紅沒藥醇產量達到 28.8 mg/L。IDI 可以協調異戊烯基焦磷酸（IPP）與其異構體二甲基烯丙基焦磷酸（DMAPP）的比例，從而減輕 DMAPP 的細胞毒性。

通過自切割肽 2A 在單個位點進行多基因表達，最終，同時過表達這兩個關鍵基因的菌株 KB-12，α-紅沒藥醇最終產量顯著提高至 171 mg/L，是初始菌株的 24 倍。

圖 | 畢赤酵母中α-紅沒藥醇生產的生物合成途徑

通過增加拷貝數增強產物表達。增加 Cc BBS基因的拷貝后，菌株 KB-13 的 α-紅沒藥醇產量達到 240 mg/L，比親本菌株 KB-12 高 49.1%。研究發現，使用柔性連接肽將 Cc BBS 與 ERG20 融合可以顯著提高 α-紅沒藥醇的產量。以菌株 KB-16 為基礎，構建了 ERG20-(GS)4-Cc BBS 的多拷貝整合，分別產生了菌株 KB-19（2 拷貝的融合蛋白）和 KB-20（3 拷貝的融合蛋白），菌株 KB-19 的 α-紅沒藥醇滴度最高，高達 1102 mg/L。

增強體內 NADPH 供應。NADPH 是萜類化合物生物合成的還原驅動力，甲醇解離途徑提供豐富的 NADH，研究人員過表達內源性 NADH 激酶 POS5，將其轉化為 NADPH。最終表達完整內源性 POS5，α-紅沒藥醇滴度達到 1486 mg/L。

過表達分子伴侶和轉錄因子促進產物合成。轉錄因子在調控相關基因表達中起著重要作用；分子伴侶可以幫助其他蛋白質正確折疊和有序組裝。過表達轉錄因子和分子伴侶通常用于緩解細胞應激并促進蛋白質功能表達。內質網中的蛋白質折疊是一個氧化過程，依賴于蛋白質二硫鍵異構酶 (PDI1) 和內質網氧化酶 1 (ERO1)。表達內源性 ERO1 的菌株 KB-30，α-紅沒藥醇滴度達到了1877mg/L。

為了評估 KB-30 的工業應用潛力，采用補料分批法在 5 L 發酵罐中進行擴大規模發酵。通過切換碳源，采用兩階段發酵工藝，用于細胞生長（階段I）和α-紅沒藥醇積累（階段II）。118h 后，α-紅沒藥醇產量提高到 32.8 g/L，為目前報道的 α-紅沒藥醇從頭合成的最高產量。

1.https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.jafc.4c11904

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