D-乳酸作為乳酸的一種旋光異構(gòu)體，在包裝、食品、制藥等多個(gè)行業(yè)有著廣泛的應(yīng)用。比如在食品行業(yè)，它能夠作為酸味調(diào)節(jié)劑，賦予食品獨(dú)特的風(fēng)味，廣泛應(yīng)用于各類食品的加工。而且，在可生物降解塑料——聚乳酸的生產(chǎn)中，D-乳酸更加不可或缺，當(dāng) D-乳酸和 L-乳酸混合時(shí)，可以形成一種特殊的立體復(fù)合物結(jié)構(gòu)，從而極大地提升聚合物的熱穩(wěn)定性，這也令 D-乳酸的市場需求日益增長。然而，目前 D-乳酸的產(chǎn)量較低、價(jià)格昂貴，開發(fā)一種高效的 D-乳酸生產(chǎn)方法迫在眉睫。

近期，來自大阪公立大學(xué)化學(xué)工程系 Ryosuke Yamada 團(tuán)隊(duì)于Biotechnology for Biofuels and Bioproducts發(fā)表了一項(xiàng)題為“Enhancing D-lactic acid production by optimizing the expression of D-LDH gene in methylotrophic yeast Komagataella phaffii”的研究，該研究借助Komagataella phaffii（畢赤酵母），成功實(shí)現(xiàn)利用甲醇高效生產(chǎn) D-乳酸，并創(chuàng)造了目前以甲醇為唯一碳源時(shí)的最高產(chǎn)量記錄。

在這項(xiàng)研究中，科研人員通過優(yōu)化 D-乳酸脫氫酶（D-LDH）基因在畢赤酵母中的表達(dá)，來實(shí)現(xiàn)從甲醇高效生產(chǎn) D-乳酸的目標(biāo)。他們首先利用 5 種不同來源的 D-LDH 基因（分別來自德氏乳桿菌 Lactobacillus delbrueckii、腸膜明串珠菌 Leuconostoc mesenteroides、乳酸明串珠菌 Leuconostoc lactis、假腸膜明串珠菌 Leuconostoc pseudomesenteroides 和芽孢乳桿菌屬 Sporolactobacillus laevolacticus）和 8 種啟動(dòng)子（包括 4 種甲醇誘導(dǎo)型啟動(dòng)子和 4 種組成型啟動(dòng)子）構(gòu)建了一系列質(zhì)粒。在將其成功轉(zhuǎn)化到畢赤酵母 GS115 菌株中后，研究人員分析了 5 種不同微生物來源 D-LDH 的工程菌株的生長態(tài)勢、代謝物水平以及 D-LDH 的活性。其中，表達(dá) LlDLDH（德氏乳桿菌）和 LpDLDH（假腸膜明串珠菌）基因的菌株展現(xiàn)出明顯的產(chǎn)量優(yōu)勢，產(chǎn)生的 D-乳酸濃度遠(yuǎn)高于表達(dá)傳統(tǒng) LmDLDH 基因的菌株。

圖|在 pAOX1 啟動(dòng)子控制下，5 種不同微生物來源 D-LDH 的工程菌株的 D-乳酸產(chǎn)量

隨后，研究人員進(jìn)一步深入探究不同啟動(dòng)子對 LlDLDH 表達(dá)的影響。最終發(fā)現(xiàn)，在 8 種不同啟動(dòng)子的調(diào)控下，pCAT1 和 pFLD1 這兩種啟動(dòng)子在促進(jìn) D-乳酸產(chǎn)生方面表現(xiàn)尤為出色。

基于以上結(jié)果，研究人員構(gòu)建了攜帶 LlDLDH 基因和 pCAT1 或 pFLD1 啟動(dòng)子的多拷貝整合質(zhì)粒，并再次轉(zhuǎn)化到畢赤酵母 GS115 中。經(jīng)過多輪篩選和基因擴(kuò)增，成功獲得了一系列工程菌株。

隨后，研究人員對這些具有高產(chǎn)潛力的菌株進(jìn)行轉(zhuǎn)化后基因擴(kuò)增，并再次篩選。實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)表明，在一定抗生素 zeocin 濃度下對工程菌株進(jìn)行基因擴(kuò)增后，能夠顯著提高 D-乳酸的產(chǎn)量。而且，其中的 GS115_CFL/Z3/04 菌株表現(xiàn)更是脫穎而出，在培養(yǎng) 120 小時(shí)后，D-乳酸產(chǎn)量達(dá)到了 5.18g/L，創(chuàng)造了目前以甲醇為唯一碳源時(shí)的最高產(chǎn)量記錄！

圖|轉(zhuǎn)化后基因擴(kuò)增菌株的搖瓶中，不同菌株甲醇濃度、D - 乳酸產(chǎn)量

通過優(yōu)化基因和啟動(dòng)子的組合、合理運(yùn)用多個(gè)啟動(dòng)子、將基因精準(zhǔn)整合到 rDNA 位點(diǎn)以及進(jìn)行轉(zhuǎn)化后基因擴(kuò)增等一系列技術(shù)手段，該研究顯著的提高了微生物生產(chǎn)目標(biāo)產(chǎn)物的效率，也為傳統(tǒng) D-乳酸的化學(xué)生產(chǎn)提供了一個(gè)可行的、環(huán)保的替代方案。相信未來，隨著該技術(shù)的進(jìn)一步推廣，有望實(shí)現(xiàn) D-乳酸的高效、穩(wěn)定、大規(guī)模的工業(yè)生產(chǎn)。

1. Inoue, Y., Yamada, R., Matsumoto, T. et al. Enhancing D-lactic acid production by optimizing the expression of D-LDH gene in methylotrophic yeast Komagataella phaffii. Biotechnol Biofuels 17, 149 (2024). https://doi.org/10.1186/s13068-024-02596-0

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