近日，中國醫學科學院蘇州系統醫學研究所葉子璐研究員和團隊開發出一套新的單細胞蛋白質組學工作流程——Chip-Tip。

圖 | 葉子璐（來源：葉子璐）

Chip-Tip 的檢測靈敏度有著巨大飛躍，他們在一顆 HeLa 細胞中鑒定出了超過 5000 種蛋白質，這是以前難以想象的深度。

更令人興奮的是，還能直接在單細胞水平觀測到蛋白質的翻譯后修飾（比如磷酸化、糖基化等）。而傳統方法通常需要額外的富集步驟才能檢測這些修飾，多細胞實驗尚且如此，單細胞就更加難以做到。而 Chip-Tip 突破了這個限制，在一顆細胞中就識別出多種修飾的蛋白。

這說明本次方法提供了前所未有的全面視角。相比以前的一些單細胞蛋白質組方法，不需要引入載體蛋白（有些傳統方法會混入額外細胞來提升信號），也不需要對樣本做復雜預處理，就能又快又靈敏地完成分析。

因此，Chip-Tip 大幅提升了單細胞蛋白質組學的靈敏度和通量，克服了長期以來困擾該領域的許多技術難題。

（來源：Nature Methods）

之所以具備這些亮點，是因為這一方法包含了從樣本制備到檢測分析的一系列創新。

首先，在樣本制備上，他們設計并使用了一種名為 ProteoCHIP EVO 96 的微型芯片。簡單來說，就是把單個細胞放進芯片上極小的孔里進行處理。通過壓電聲學技術，能在納升級體積中完成細胞裂解和蛋白質提取，這樣就最大程度減少了蛋白質粘附在管壁上或丟失的情況。

傳統方法處理這么微量的樣本時常常損失嚴重，而他們的芯片等于是給每個細胞準備了一個“迷你容器”，保證把細胞里的蛋白都抓取出來。每個芯片最多可以并行處理 96 個單細胞樣本，這使得只需一次實驗就能分析許多細胞，大大提高了效率。

其次，在檢測技術上，他們結合了當前最先進的質譜分析手段。利用高速高靈敏度的液相色譜-質譜聯用系統（比如最新一代的 Orbitrap Astral 質譜儀），可以在不進行任何標記或富集的情況下直接檢測單個細胞的蛋白質。

審稿人認為，這項技術在單細胞蛋白質組學領域實現了重要突破，一舉解決了靈敏度和規模化兩個大問題，達到了以前難以達到的深度。還有審稿人評論說 Chip-Tip 工作流程為該領域設立了新的標桿，這讓該團隊備受鼓舞。

在論文發表后，Nature Methods雜志方告訴研究團隊，他們專門邀請了一位審稿專家撰寫評論文章（也稱News & Views）來介紹和評價這項成果。

“能夠得到這樣的待遇，是對我們工作的充分肯定——一般只有被認為具有重大影響力的研究，雜志才會邀請同行專家撰寫獨立評論。評論文章中，專家對我們工作的創新意義給予了高度評價，認為這項技術推動了領域進入深度單細胞蛋白質組學時代?！比~子璐表示。

Chip-Tip 的應用前景十分廣泛，尤其是與大數據和 AI 技術相結合后，將進一步加速科學發現。目前主流的單細胞研究主要集中在單細胞轉錄組（scRNA-seq）水平，蛋白質層面的數據是缺失的。

單細胞蛋白質組學能直接測量每個細胞內的蛋白質表達情況，更精準地反映細胞的狀態和功能。未來，通過大數據分析與 AI 算法的助力，單細胞蛋白質組學將發揮更大的作用。

比如：利用 AI 快速分析數以萬計的單細胞蛋白數據，發現新的細胞類型與生物標志物；結合 scRNA-seq 數據，構建多組學分析模型，深入揭示細胞發育軌跡與疾病發生的分子機制；以及開發智能藥物篩選平臺，快速評估藥物在單細胞水平上的治療效果，加速精準藥物的開發和臨床轉化。

（來源：Nature Methods）

單細胞蛋白質組學的能力亟待提升

蛋白質是生命活動最直接的執行者，蛋白質組學研究能夠幫助我們深入理解細胞、組織以及人體的功能機制，這對疾病的診斷、治療和預防都具有重要價值。近年來，國際上蛋白質組學的研究迅速發展，在國內也得到了越來越多的關注。

例如，由中國科學院院士賀福初領銜啟動的“π-HuB”（人體蛋白質組導航國際大科學計劃），正是中國在這個領域的重要布局。

該計劃希望通過蛋白質組學技術和數據科學的結合，系統性地繪制不同人體組織和疾病狀態下蛋白質表達變化的“地圖”，從而幫助理解人體的健康與疾病發生的規律，也為疾病診斷和精準醫學提供基礎的數據支撐。

隨著生命科學的發展，人們已經不再滿足于對成千上萬個細胞混合后得到的平均值進行研究，而是希望直接觀察每一個細胞內部發生了什么。

單細胞蛋白質組學就是在單個細胞層面研究蛋白質的種類和豐度，它的重要性在于：不同的細胞即使基因相同，蛋白質表現也可能千差萬別。

比如，在腫瘤中不同癌細胞對藥物的反應可能不同，只有看清每個細胞的蛋白質情況，才能理解這種差異。又比如，在干細胞分化過程中，每個階段細胞內哪些蛋白在變化，單細胞分析可以給出前所未有的細節。

因此，單細胞蛋白質組學被認為能夠極大改變人們對細胞功能和疾病機制的認識。但是，以往要測定單個細胞中的成千上萬種蛋白非常困難。

主要瓶頸有幾個：

• 其一是靈敏度不足——單個細胞的蛋白質含量極其微量，傳統質譜技術往往檢測不到足夠信號；
• 其二是樣本處理復雜——從單個細胞提取和保存全部蛋白質很不容易，過程中容易有損失；
• 其三是數據分析難度高——單細胞的數據本來就少，還混雜噪音，常規算法難以區分有意義的信號。

正是因為看到這些挑戰和單細胞分析的巨大潛力，他們才決心開展這項研究，希望開發出新技術來提升單細胞蛋白質組學的能力。

（來源：Nature Methods）

一波三折，在蛋白質組學的激烈競爭中前進

此前已有不少研究關注單細胞層面的分析，但大多集中在細胞轉錄組的層面，而蛋白質作為生命活動的真正執行者，信息更加豐富。

可是，由于單個細胞中蛋白質含量極低，傳統技術通常面臨兩個問題：一是單細胞樣品處理步驟復雜、樣品損失嚴重；二是蛋白質的鑒定數量有限，一般只能檢測到 1000-2000 個蛋白質，難以全面反映細胞的真實功能狀態。

為了解決這個問題，他們設計了 Chip-Tip。設計思路是通過簡化樣品的處理過程，減少蛋白質損失，從而提高單細胞內蛋白質的鑒定數量。

同時，他們設計并制作了專門的芯片，將所有樣品處理步驟都整合到芯片的微小孔內完成，整個過程中樣品幾乎沒有損失，且能批量高效地同時處理多個細胞樣品。

在最初的預實驗階段，他們先嘗試了用這種新芯片分析單個 HeLa 細胞，利用全自動單細胞分選儀把單個細胞準確地送入芯片孔內，加入裂解液釋放出細胞內蛋白質，再將蛋白質酶解成便于質譜檢測的小片段（肽段）。然后，這些肽段被直接送入液相色譜和質譜儀進行分析。

初步結果非常令人振奮——他們能夠從單個細胞中準確地鑒定出超過 5000 種蛋白質，這遠遠超過傳統方法的檢測能力。這表明他們的 Chip-Tip 方法可行，值得深入研究。

在隨后的正式實驗中，他們進一步評估了多個細胞數量（如單個細胞、10 個細胞、20 個細胞和 40 個細胞）的蛋白質檢測效果。結果發現，隨著細胞數量的增加，能檢測出的蛋白質數量也明顯增加。

同時，他們意外地發現 Chip-Tip 甚至可以直接檢測出蛋白質上發生的磷酸化等重要的“翻譯后修飾”，單個細胞中首次鑒定出超過 120 個磷酸化修飾位點。

這一結果令他們非常驚喜，因為此前在單細胞水平從未如此精細地觀察到這些蛋白質修飾的信息。為了驗證 Chip-Tip 方法在實際研究中的應用價值，他們又將它用于分析腫瘤細胞在藥物處理前后的蛋白質變化，以及誘導多能干細胞分化為不同類型細胞的過程中蛋白質表達變化，結果證明這項技術確實能發現與細胞功能和狀態相關的重要蛋白質標志物。

整個研究歷時幾年的時間，從早期提出問題，到系統技術開發，再到成功發表，他們經歷了許多技術挑戰和反復實驗。

但最終，他們不僅證明了 Chip-Tip 的高效性和可靠性，也首次實現在單個細胞中識別數千種蛋白質及其關鍵翻譯后修飾。這一成果讓他們可以更加深入、全面地理解細胞功能，推動生命科學研究更快向前發展。

（來源：Nature Methods）

另據悉，這項研究的最初想法起始于 2019 年底。當時葉子璐剛剛加入丹麥哥本哈根大學杰斯珀·奧爾森（Jesper Olsen）教授課題組從事博士后研究。

那時候，單細胞蛋白質組學領域正逐漸興起。一些研究團隊開始使用同位素標記技術，通過添加大量載體蛋白質（carrier proteome）來提高單細胞檢測的靈敏度。

但是，葉子璐當時所在課題組以及其他同行對這種方法存在一些疑慮，認為可能存在干擾或誤差，也就是所謂的“載體蛋白質組效應”（Carrier proteome effect）。

于是，葉子璐的第一個課題就是對這一效應進行系統性的研究與評估。研究剛進行不久，他們就注意到一支德國團隊的類似論文已于 2020 年發表在了Nature Methods上。

后來他們發現，德國團隊的研究實際上比他們早啟動了很久，嚴格意義上并不算搶發（scoop），但的確給他們帶來了一些挫折感。

后來，葉子璐等人認真地研讀了德國團隊的成果，發現了一些方法上的不足，決定進一步優化研究策略，尋找新的突破口。

接下來，他們又嘗試開發超高通量靶向單細胞蛋白質組分析技術，但很遺憾在他們進行到一半時，一支美國團隊又率先發表了類似論文，這使他們再次感受到了單細胞蛋白質組學領域激烈的競爭壓力。

這些早期研究雖然遇到了不少挑戰，卻幫助他們積累了大量的經驗，也讓他們對單細胞蛋白質組學技術的發展路徑有了更清晰的理解。

此時，葉子璐等人決定轉向無標記定量的單細胞蛋白質組學分析。憑借前期積累的豐富經驗，再加上與 Evosep 和 Cellenion 公司的深度合作，他們最終開發出了 Chip-Tip 這一全新的、幾乎無損的單細胞蛋白質組學技術。

2023 年 11 月，他們搶先一步在BioRxiv預印本平臺上發表了 Chip-Tip 方法的相關論文，首次展示了單細胞中超過 5000 種蛋白質的精準鑒定，在單細胞蛋白質組學領域引起極大關注。

此后不久，另一支美國團隊和一支維也納團隊的類似論文也相繼發表，但葉子璐這一次終于搶占先機。他們的了被Nature Methods順利接收，審稿過程僅經歷一輪小修便獲得認可。

然而碰巧的是，2024 年Nature Methods雜志選擇空間蛋白質組學（Spatial Proteomics）作為年度主推技術，這讓編輯部的審稿和出版工作有所延遲。

“不過整體而言，這次研究項目從最初的艱難探索到最終取得重大突破，整個過程雖然曲折，但卻極大推動了單細胞蛋白質組學領域的發展。”葉子璐表示。

日前，相關論文以《增強的靈敏度和可擴展性與芯片尖端工作流程相結合，可實現深入的單個細胞蛋白質組學》（Enhanced sensitivity and scalability with a Chip-Tip workflow enables deep single-cell proteomics）為題發在Nature Methods[1]。

葉子璐是第一作者兼共同通訊作者，丹麥哥本哈根大學杰斯珀·奧爾森（Jesper Olsen）教授擔任共同通訊作者。

圖 | 相關論文（來源：Nature Methods）

用“短跑”新技術做“從 0 到 1”的研究

葉子璐表示：“我在奧爾森教授實驗室工作期間，單細胞蛋白質組學領域的競爭非常激烈，很多時候我們的研究都面臨著‘你不做別人也會做’的壓力。這種‘數字游戲’（即誰率先獲得更好的數據）在某種意義上推動了領域的發展?！?/p>

“盡管我們多次被同行搶先一步，但總體來看我們團隊的工作效率仍然非常高，最終也取得了一系列高質量的研究成果。從某種意義上來說，我們在這個‘數字游戲’里算是表現不錯的‘玩家’，而這樣的激烈競爭，也的確加速了整個蛋白質組學領域的技術進步。”他表示。

然而，這樣的競爭也促使葉子璐反思，他希望回到國內組建自己團隊時，能夠做一些真正意義上的原創性研究，即能夠“從 0 到 1”，而不僅僅是“數量”上的比拼，更希望做出不易被搶發的、真正具有原創性價值的研究。

他繼續說道，回國之后從人才招募到平臺搭建，團隊整體效率還算比較高，但初期原創技術的開發和高質量數據產出的速度還是不夠快，很多工作仍需從零開始積累。

不過在這種模式下，他和團隊也開始做出一些令人興奮的進展，其中最值得一提的是他們研發的一款名為 SPRINT 的單細胞蛋白質組學樣品前處理儀器。

Chip-Tip 雖然在單細胞蛋白質檢測靈敏度方面取得了突破，但葉子璐更希望進一步提升分析的通量（number of cells）。

正如前面提到的，Chip-Tip 一次可以處理最多 96 個單細胞樣本。盡管這已經相對不錯，但如果面對更大規模的研究或者臨床應用需求，96 個/批次可能仍嫌不夠。

為此，他和團隊在規劃一種代號為 SPRINT 的新技術平臺。這個名字有“短跑”之意，寓意著高速和高效。SPRINT 平臺打算在 Chip-Tip 現有流程的基礎上，再向前邁進一步——進一步減少人工操作、讓整個流程更加高效。

目前，他們正在開發的 SPRINT 原型儀器正是朝這個目標邁出的關鍵一步。此外，他們在組織樣品的自動化處理、超高通量液相色譜分析方法的研發方面也都與多個工業界和學術界團隊建立了深度合作，正在快速配合實現關鍵突破。

眼下，葉子璐已經展開了這方面的研究，希望能把每天分析的單細胞數量從現在的一百來個提升到幾百甚至上萬個。

未來，他的目標是打造類似于 10x Genomics 那樣的平臺型技術公司，希望不僅能夠為學術界提供強大的技術工具，也能服務于更廣泛的生物醫藥產業。雖然現在仍處于前期規劃階段，但團隊已經在逐步準備。

參考資料：

1.Ye, Z., Sabatier, P., van der Hoeven, L.et al. Enhanced sensitivity and scalability with a Chip-Tip workflow enables deep single-cell proteomics.Nat Methods22, 499–509 (2025). https://doi.org/10.1038/s41592-024-02558-2

運營/排版：何晨龍