“抗體依賴性細胞介導的細胞毒性（ADCC）是一種重要的免疫防御機制，它通過動員免疫系統的效應細胞來清除標記有特定抗體的異常或病變細胞。本文將對ADCC的基本原理、作用機制以及在抗體藥物開發中的應用進行全面總結。”

01

什么是ADCC？

ADCC（Antibody-dependent Cellular Cytotoxicity）是指當特定抗體與靶細胞表面的抗原結合后，抗體的Fc區域能夠與免疫效應細胞（主要是NK細胞，但也包括巨噬細胞、中性粒細胞和嗜酸性粒細胞）表面的Fcγ受體結合，激活這些效應細胞，進而引發細胞毒性反應，最終導致靶細胞的破裂和死亡。

圖片來源于Sigma官網https://www.sigmaaldrich.com/US/en/technical-documents/technical-article/cell-culture-and-cell-culture-analysis/primary-cell-culture/adcc-assay-bioivt-cryopreserved-nk-cells

在介導ADCC過程中，最關鍵的Fc受體是FcγRIIIa（也稱為CD16a），主要表達在自然殺傷（NK）細胞上。FcγRIIIa能夠與抗體（通常是IgG）的Fc區域結合，從而觸發NK細胞釋放細胞毒性分子，比如穿孔素（perforin）和格朗齊酶（granzymes）的顆粒。穿孔素在靶細胞膜上形成孔洞，使格朗齊酶能夠進入靶細胞內部，從而觸發細胞凋亡。同時，效應細胞還會釋放多種細胞因子（干擾素-γ（IFN-γ），增強靶細胞的抗原呈遞和免疫細胞的活性；腫瘤壞死因子-α（TNF-α），直接對靶細胞具有毒性作用，并促進炎癥反應；粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF），有助于激活和增殖其他免疫細胞；其他趨化因子，如MIP-1α和RANTES，也參與調控免疫細胞的募集和定位），這些細胞因子能夠增強局部的免疫反應，協同殺傷靶細胞。

此外，FcγRI和FcγRIIa也能在一定程度上介導ADCC，通常出現在巨噬細胞和中性粒細胞上，但它們在ADCC中的作用相對次要。

與依賴補體系統的細胞裂解不同，ADCC完全依賴于細胞介導的殺傷，因此具有高度特異性和調控性。

思考

1如果抗體沒有結合靶細胞， Fc 會和FcRs 結合嗎？如果這樣，不是只要抗體存在就會觸發免疫反應？

答：在沒有靶細胞的情況下，抗體通常以單體形式存在，其Fc區域分散且不形成聚集狀態。只有當抗體與靶細胞表面的抗原結合后，會形成多價的免疫復合物，從而在細胞表面實現Fc區域的密集聚集。這種聚集效應能夠顯著增強與Fc受體的結合并觸發信號傳導，進而激活效應細胞。而單個抗體分子由于無法形成足夠的交叉聯結，其與Fc受體的結合通常是短暫且弱的，不足以引起細胞激活。

以IgG1為例，其Fc區與各類Fc受體和FcRn的親和力存在明顯差異，通常的估計值如下：

FcγRI (CD64)：親和力很高，約在10^8 M?1左右，對應的KD大約在10?? M量級。

FcγRII (CD32)：親和力較低，約在10^6 M?1左右，對應的KD約在10?? M左右。

FcγRIII (CD16)：親和力一般在10^6到10^7 M?1之間，對應KD可能在10??–10?? M范圍。

FcRn：與IgG1的結合是pH依賴的。在酸性環境（如pH6.0）下，其親和力較高，KD約在100-300 nM；而在中性pH（7.4）下，結合非常弱，幾乎不發生結合。

2 聚集效應為什么能夠顯著增強與Fc受體的結合并觸發信號傳導？

答：這種聚集效應的結構基礎主要在于多價結合（multivalency）的增強作用。單個IgG分子與Fc受體的親和力較低，但當抗體與靶細胞上的抗原結合形成免疫復合物時，其Fc區域會密集聚集在一起。這種聚集狀態允許多個Fc受體同時與復合物上的多個Fc區域結合，從而顯著提高整體的結合力（avidity）。這種多點接觸和交叉聯結不僅增強了Fc受體的結合，還促使受體在細胞膜上聚集和交聯，觸發下游信號最終激活效應細胞。

3 Fc受體的聚集怎么觸發免疫反應SH2結構域的信號分子？

答：具備激活功能的Fc受體，如FcγRI、FcγRIIa和FcγRIIIa，在交叉聯結后會通過ITAM區域磷酸化和隨后招募含SH2結構域的信號分子，從而觸發免疫反應。而像FcγRIIb這樣的抑制性Fc受體則具有ITIM結構域，主要發揮負調控作用，不會通過這種機制激活免疫反應。

ITAM區域磷酸化：當Fcγ受體因抗體交叉聯結而聚集時，其胞內的免疫受體酪氨酸活化基序（ITAM）會被Src家族激酶磷酸化。

SH2結構域信號分子的招募：磷酸化的ITAM區域為含SH2結構域的信號分子（如Syk或ZAP70）提供結合位點，這些分子的結合進一步激活下游信號級聯，最終觸發效應細胞的免疫反應。

02

工程化改造方法

在抗體藥物開發領域，ADCC是許多抗體發揮治療效應的重要機制。通過工程化改造抗體的Fc區域，研發人員可以根據不同的治療需求調控ADCC功能。具體來說：

1增強ADCC

通常通過對抗體的Fc區域進行工程化改造來提高其與效應細胞上FcγRIIIa（CD16a）受體的結合親和力，進而增強NK細胞的殺傷能力。這種策略在抗腫瘤治療中尤為常見，能夠提高抗體對腫瘤細胞的殺傷力。典型的例子包括Obinutuzumab（Gazyva）和Mogamulizumab（Poteligeo）。

去巖藻糖化（Defucosylation）

在N-連接糖基化中，保守的motif通常為N-X-S/T。以人IgG為例，其Fc區域在CH2結構域中有一個關鍵的N-連接糖基化位點，即第297位的天冬氨酸（N297），這是最為人熟知的糖基化位點。通過減少Fc區糖基中的巖藻糖殘基，顯著提高抗體與FcγRIIIa的結合親和力，從而增強ADCC。

2011年Roche在PNAS上發表文章闡述缺乏核心巖藻糖化的抗體與FcγRIIIa的親和力顯著增加，從而提高了受體介導的效應功能（如下圖A, SPR 結果）。

圖片來源于 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (31) 12669-12674, https://doi.org/10.1073/pnas.1108455108 (2011).

N-連接糖基化位點上的碳水化合物鏈通常由N-乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc）和甘露糖組成的復雜型七糖核心構成，隨后還可以變異性地添加半乳糖、唾液酸、巖藻糖以及分枝的GlcNAc殘基（如上圖B）。

圖片來源于 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.108 (31) 12669-12674, https://doi.org/10.1073/pnas.1108455108(2011).

Roche發現FcγRIIIa在Asn162位點所連接的碳水化合物與無巖藻糖化的Fc區域之間可能形成有效的接觸。這些附加的糖鏈對于免疫球蛋白的功能發揮至關重要。與無巖藻糖化或有巖藻糖化Fc結合的糖基化Fcγ受體的晶體結構，詳細闡明了Fc-寡糖核心巖藻糖化在改善ADCC中的調控作用。結構顯示，無巖藻糖化的Fc與受體之間形成了一種獨特的界面，這一界面依賴于受體和無巖藻糖化Fc糖鏈之間的碳水化合物–碳水化合物相互作用；而在有巖藻糖化Fc的復合物中，這些相互作用要弱得多或不存在，從而解釋了其較低的受體親和力。

S239D/I332E mutation：增加RcγRIIIa和FcγRIIb的親和力

S239D/I332E突變首次被報道是在抗體工程領域的一篇具有里程碑意義的論文中，該論文于2006年由Xencor的Lazar等人撰寫發表于PNAS。該文作者利用Protein Design Automation (PDA)和Sequence Prediction Algorithm (SPA)等蛋白質工程的方法，通過同源建模對復合物結構分析，將IgG1 Fc區域中的S239替換為天冬氨酸（D）和I332替換為谷氨酸（E），顯著增強了抗體與FcγRIIIa的結合親和力，從而提升了抗體依賴性細胞介導的細胞毒性（ADCC）活性。該研究詳細描述了這項工作為后續的抗體Fc工程化設計提供了堅實的結構基礎和理論依據。

圖片來源于Engineered antibody Fc variants with enhanced effector function, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103 (11) 4005-4010.

在Fc/FcγR復合物結構的鏈A上，I332參與了一系列暴露于表面的配位相互作用，而S239與受體的K120發生相互作用（圖8B）。在鏈B上，I332處于類似的配位環境，而S239則處于未成對狀態；不過，它們均與受體殘基K161的距離在5 ?以內，且S239與受體殘基S160的距離在6 ?以內。將S239和I332突變為極性，尤其是帶電的極性殘基，通常能顯著提高FcγRIIIa的親和力。其中，S239D/I332E變體是這一系列中效果最好的，其可能提供了與受體殘基K120、S160和K161之間最優的相互作用網絡。

AAA mutation

2001 年，Genetech繪制出人IgG1與人FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB、FcγRIIIA以及FcRn受體結合位點的高分辨率圖譜。其中，Ser298Ala、Glu333Ala和Lys334Ala突變的組合（AAA突變）對IgG1與FcγRIIIa的親和力有累加性改善。這種增強的結合力轉化為在體外使用Herceptin抗體時，對Her2陽性細胞的殺傷效力提高了50至100倍。

圖片來源于 Journal of Biological Chemistry. 2001 Mar 2;276(9):6591-604.

2 沉默ADCC

在某些情況下，為了減少非特異性免疫活性和相關毒性，抗體的Fc區域會被設計成不與Fcγ受體結合，如通過LALA或N297A等突變，使得抗體在發揮阻斷或調節作用時不引起不必要的細胞毒性。這類設計常見于免疫檢查點抑制劑，例如Atezolizumab（Tecentriq）和Durvalumab（Imfinzi）。

Asn297Ala/Gly/Gln mutation: 減弱對 FcγRI和 IIIa 和 C1q 親和力

圖片來源于Frontiers in Immunology. 2019 ;10:1296. DOI: 10.3389/fimmu.2019.01296.

去除IgG Fc區的Asn297糖鏈會顯著降低Fc與Fcγ受體的結合，這是因為這種去糖基化會誘導Fc區呈閉合構象。一些Fc設計通過引入Asn297Gly或Asn297Glu突變來移除297位的N-連接糖基化位點。圖中展示了帶糖基化的IgG1 Fc（灰色），其N297糖鏈顯示為品紅色（PDB: 4BYH）；而在297位引入Gly或Glu殘基后，得到無糖基的IgG1 Fc（藍色和淺紫色；PDB: 3S7G）。將帶糖和無糖的Fc晶體結構疊加后可以看出，無糖型Fc的淺紫色和藍色CH2結構域比帶糖型Fc的灰色CH2結構域更為接近。這種CH2構象的改變被認為是解釋無糖型Fc降低Fcγ受體結合能力的結構原因。

LALA mutation：減弱RcγRI，II和 III

“LALA突變”指的是在抗體Fc區域中將亮氨酸234和亮氨酸235（Leu234和Leu235）分別替換為丙氨酸（Ala），即L234A/L235A突變。這一突變的主要目的是顯著降低抗體與Fcγ受體的結合親和力，從而沉默抗體的效應功能，特別是抗體依賴性細胞介導的細胞毒性（ADCC）。

研究表明，將Leu235突變為Glu就足以在U937細胞上完全消除對Fc受體的結合，使與Fcγ受體的結合降低了100倍，從而在存在Leu235Glu突變的IgG1中降低了T細胞激活和增殖。基于這一初步突變，進一步能夠消除IgG1和IgG4對FcγRI、IIa和IIIa的可檢測結合。與單獨使用Leu234Ala或Leu235Ala相比，LALA突變的效果更為顯著。在234和235位的單一或雙重突變均降低了由外周血單個核細胞（PBMCs）介導的ADCC活性，并幾乎完全消除了由單核細胞介導的ADCC。LALA突變已在一期臨床試驗中得到測試。編碼LALA突變的抗CD4抗體OKT3被用于治療急性腎移植排斥反應，該IgG1攜帶LALA突變引起的不良反應極少，并在7名患者中成功逆轉了6例移植排斥。

LALA-PG Mutation

類似地，在LALA突變中添加Pro329Gly突變，也能抑制IgG2a Fc與小鼠FcγRI、II和III的結合。位置329的氨基酸之所以被改變，是因為該殘基與FcγRIIIa的Trp108和Trp131接觸。LALA-PG突變相比單獨的LALA突變有改進，因為它能夠在小鼠和人類IgG中完全消除Fc功能，而單獨的LALA突變仍保留小鼠IgG2a與小鼠FcγRIII的結合。LALA-PG突變的重要意義在于，其在小鼠模型中觀察到的結果預計能更準確地轉化到人類，因為這些突變在小鼠IgG2a和人類IgG1中賦予了相似的表型。

總結

抗體依賴性細胞介導的細胞毒性（ADCC）作為一種關鍵的免疫防御機制，在抗體藥物治療中發揮著至關重要的作用。通過精準標記和調動免疫細胞，ADCC能夠有效清除異常或病變細胞，并為癌癥、感染等多種疾病的治療提供支持。隨著生物工程技術的發展，針對ADCC的調控策略不斷優化，為實現更安全、更有效的免疫治療奠定了堅實的基礎。

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