柚皮素（(2S)-Naringenin）是一種廣泛存在于柑橘類水果中的天然黃酮類化合物，因其抗炎、抗氧化和抗菌等多重藥理活性，在食品、醫藥及功能性化妝品領域具有廣泛應用。

江南大學周景文團隊長期致力于柚皮素的高效生物合成。此前，他們通過酶工程與代謝工程優化了釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的代謝通量，使柚皮素的微生物合成產量達到了 3.4 g/L，在當時已處于領先水平。然而，釀酒酵母在前體供應和代謝通量方面仍存在瓶頸，難以支撐更大規模的工業化生產。

此次，研究團隊選擇了解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）作為宿主，結合酶工程與代謝工程優化策略，成功構建了一條高效的從頭合成柚皮素路徑，將產量提升至 8.65 g/L，實現了突破性提升。相關成果以“High-Level De Novo Production of (2S)-Naringenin in Yarrowia lipolytica Using Metabolic and Enzyme Engineering”為題發表在 ACS Agricultural Science & Technology 上。

研究團隊首先著手構建柚皮素的生物合成路徑，并選擇了解脂耶氏酵母作為宿主。通過篩選柚皮素合成酶，發現來自槐樹的查爾酮合成酶（SjCHS）與苜蓿查爾酮異構酶（MsCHI）組合效果最佳，初始菌株 NAG03 搖瓶發酵產量達 24.1 mg/L。然而，前體對香豆酸大量積累，濃度高達 168.3 mg/L，提示代謝路徑存在瓶頸。

圖 | 在解脂耶氏酵母中構建柚皮素生物從頭合成途徑

在確認了酵母中柚皮素的初步合成能力后，研究團隊針對關鍵酶 SjCHS 的催化效率進行了深入的優化。針對限速酶 SjCHS 活性不足的問題，團隊采用分子對接與動力學模擬技術，解析酶-底物相互作用，鎖定關鍵催化位點。通過 V196A 突變使產量提升至 29.3 mg/L，進一步引入 T132C 極性突變后，產量增至 38.4 mg/L。分子模擬顯示，突變后酶與底物結合更緊密，氫鍵作用增強，催化效率顯著提高。

為提高前體供應，團隊改造莽草酸途徑，解除L-酪氨酸合成的反饋抑制，并通過多拷貝整合技術將 CHS 和 CHI 基因拷貝數增至 4 個，使產量躍升至 246.4 mg/L。補充 100 mg/L L-酪氨酸后，前體轉化效率進一步提升，但對香豆酸殘留仍達 45.2 mg/L，表明下游代謝需進一步優化。

研究引入非天然的丙二酰輔酶 A 生物合成途徑，增強丙二酰輔酶 A 供應，同時增強 NADPH 的供應，柚皮素的滴度可達 615.0mg/L，同時有一定的對香豆酸積累。

針對前體殘留問題，團隊在進行了一系列優化，利用多拷貝整合技術，將 Pc4CL、SjCHS 和 MsCHI 等基因的表達框架整合到解脂耶氏酵母的基因組中，使對香豆酸轉化率提高至60%，使得柚皮素的生產能力達到了 776.3 mg/L。在 5L 發酵罐中，采用無機鹽為氮源進行補料分批發酵，經 156 小時培養，(2S)-柚皮素產量達 8.65 g/L，對香豆酸近乎耗盡，實現高效轉化。

本研究通過酶工程與代謝工程的結合，成功優化了解脂耶氏酵母的柚皮素合成路徑，將產量提升至 8.65 g/L，刷新了在解脂耶氏酵母中合成該化合物的最高紀錄。這一突破不僅驗證了解脂耶氏酵母作為類黃酮合成宿主的巨大潛力，也為未來的工業化生產奠定了基礎。

未來的研究可進一步優化代謝通量，減少副產物積累，提高底物利用率。此外，通過發酵工藝改進和系統生物學手段，如動態代謝調控和人工代謝通路設計，柚皮素的生產成本有望進一步降低，實現更大規模的工業應用。這一研究不僅推動了綠色生物制造的發展，也為功能食品、藥物和化妝品等領域提供了可持續的原料供應方案。

Ziyun Ru, Mengsu Liu, Qihang Chen, et al. High-Level De Novo Production of (2S)-Naringenin in Yarrowia lipolytica Using Metabolic and Enzyme Engineering[J]. ACS Agricultural Science & Technology Article ASAP,DOI: 10.1021/acsagscitech.4c00729

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