【導讀】匯集光學篩選可以研究大規(guī)模的細胞相互作用、形態(tài)學或動力學，但它們尚未利用高度復雜的單細胞分辨轉(zhuǎn)錄組讀數(shù)的力量為分子通路提供信息。

2025年3月12日，美國麻省理工學院/哈佛大學的研究團隊在期刊《Cell》上發(fā)表了題為“Simultaneous CRISPR screening and spatial transcriptomics reveal intracellular, intercellular, and functional transcriptional circuits”的研究論文。

https://www.cell.com/cancer-cell/fulltext/S1535-6108(25)00061-3

Perturb-FISH推進了細胞內(nèi)回路的功能基因組學研究，并為細胞間回路的遺傳學研究提供了豐富的分子細節(jié)。該方法不僅能夠揭示細胞內(nèi)擾動的分子機制，還能解析細胞間相互作用的復雜網(wǎng)絡(luò)，為理解細胞在組織尺度上的功能提供了新的視角。

01

研究背景

光學集合篩選將原位gRNA測序與成像分析相結(jié)合，為基于測序的集合篩選提供了一種替代方法。將原位基因表達譜的空間轉(zhuǎn)錄組測量結(jié)合起來，不僅可以探測細胞內(nèi)和細胞間水平的基因調(diào)控回路，還能將這些數(shù)據(jù)與系統(tǒng)的功能測量配對，如延時記錄細胞對給定刺激的反應(yīng)。雖然這種方法成功地將轉(zhuǎn)錄組學、CRISPR干擾和空間信息配對起來，但蛋白質(zhì)條形碼的使用犧牲了集合克隆工作流的優(yōu)勢，Visium的空間分辨率也限制了這種方法在非克隆生長細胞上的應(yīng)用。因此，科學界仍然需要一種工具，將單細胞空間測量與原位gRNA大規(guī)模讀取的優(yōu)勢結(jié)合起來。

02

Perturb-FISH恢復組織中基因擾亂的影響：在免疫受損小鼠體內(nèi)移植的擾亂人類黑色素瘤細胞中探究NF-κB通路

研究人員發(fā)現(xiàn)了276種顯著的細胞間腫瘤免疫效應(yīng)，當把數(shù)據(jù)隨機分成兩半檢查一致性時，這些效應(yīng)仍然相關(guān)。腫瘤細胞中的IRAK1、LBP或TAB2的KOs對T細胞基因表達有強烈的相關(guān)影響，它們都下調(diào)了TNFRSF9等活化標志物和ZBED2。CD8A和TIGIT受到LBP-KO和TAB2-KO的影響也非常相似。已知CD8A、TIGIT和TNFRSF9在T細胞中共同表達，它們的同時過表達與預后不良有關(guān)。相反，這些基因在CHUK KOs腫瘤細胞鄰近的T細胞中也有過表達。腫瘤細胞中的MAP2K2-KO也會導致免疫檢查點受體配體PDCD1LG2的顯著過表達和細胞毒性標志物GNLY的下調(diào)。MAP2K2基因突變與黑色素瘤免疫檢查點抑制劑治療失敗有關(guān)。在IRF7-KO附近，幼稚T細胞標志物CXCR4、CD5和CD28下調(diào)，但在IRAK1-KO附近上調(diào)。研究表明，IRF7的上調(diào)可促進T淋巴細胞和B淋巴細胞的擴增，而其沉默則會產(chǎn)生相反的效果。IRAK1的高表達與預后不良和免疫療法獲益減少有關(guān)，這證實了它們對T細胞的相反影響。

腫瘤異種移植中g(shù)RNA干擾結(jié)果的一致性，以及不同鄰域組成的比較。

03

總結(jié)

1. Perturb-FISH方法的優(yōu)勢：
研究團隊開發(fā)了一種名為Perturb-FISH的全光學實驗方法，能夠在單細胞分辨率下研究空間和功能生物學的遺傳與分子關(guān)聯(lián)。該方法能夠穩(wěn)健推斷細胞內(nèi)擾動效應(yīng)，其功效與Perturb-seq相當，但專注于目標基因的表達。Perturb-FISH的關(guān)鍵優(yōu)勢在于能夠?qū)⑦z傳擾動的細胞內(nèi)效應(yīng)與功能讀數(shù)（如實時鈣成像）相匹配，從而揭示細胞內(nèi)、細胞間以及功能轉(zhuǎn)錄回路的復雜關(guān)系。

2. Perturb-FISH在功能基因篩選中的應(yīng)用：
研究通過篩選星形膠質(zhì)細胞中的ASD風險基因并記錄其對ATP刺激的鈣活性，證明了Perturb-FISH的可行性。該方法不僅能夠揭示基因?qū)D(zhuǎn)錄組的影響，還能關(guān)聯(lián)基因功能（如鈣活性），并識別出可能導致特定表型的靶標。此外，Perturb-FISH還揭示了ASD風險基因的潛在通路，強調(diào)了星形膠質(zhì)細胞在ASD中的可能作用。

3. Perturb-FISH的可擴展性與兼容性：
Perturb-FISH借鑒了MERFISH的向?qū)l形碼策略，能夠識別多達550個gRNA，具有較高的可擴展性。該方法不僅兼容CRISPR-KO和CRISPRi，還適用于其他基于gRNA的擾動技術(shù)（如堿基編輯、CRISPR-a、CRISPR-off和非Cas9系統(tǒng)）。此外，通過在U6啟動子中插入T7啟動子，可以進一步優(yōu)化gRNA的讀出效率。

4. 細胞間效應(yīng)的檢測與篩選策略：
Perturb-FISH能夠檢測細胞擾動的細胞外效應(yīng)，這對于理解細胞間網(wǎng)絡(luò)和組織功能至關(guān)重要。然而，觀察鄰近細胞的影響需要更高的對照向?qū)П壤图毎芏龋源_保特定細胞對的出現(xiàn)率。因此，Perturb-FISH篩選可能需要比傳統(tǒng)Perturb-seq更多的對照向?qū)В蕴岣吆Y選功率。

參考資料：

1.Chen, S. ? Sanjana, N.E. ? Zheng, K. ...

Genome-wide CRISPR screen in a mouse model of tumor growth and metastasis

Cell. 2015; 160:1246-1260

2.Kerek, E.M. ? Cromwell, C.R. ? Hubbard, B.P.

Identification of drug resistance genes using a pooled lentiviral CRISPR/Cas9 screening approach

Methods Mol. Biol. 2021; 2381:227-242

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