中文摘要

目的驗證無酚紅M199培養基的貯存效期，同時探索無酚紅M199效期對無酚紅Sabin株脊髓灰質炎滅活疫苗（inactivated Sabin strain poliovirus vaccine，sIPV）關鍵質量屬性的影響。

方法對貯存0、6、12、18、24、30、36及42個月的3批次無酚紅M199干粉培養基進行外觀、澄清度、pH、干燥失重、細菌內毒素、微生物限度等物理化學性質及微生物性質長期監測；檢測用貯存36個月并檢定合格的無酚紅M199制備的sIPV成品關鍵質量屬性；將近效期和遠效期無酚紅M199制備的各3批sIPV分別貯存于37 ℃和25 ℃進行穩定性監測，檢測D抗原含量，評價其穩定性；用2組sIPV免疫大鼠，檢測大鼠血清抗體效價，評價其免疫原性。

結果無酚紅M199干粉培養基于2~8 ℃貯存42個月后的外觀、澄清度、pH、干燥失重、細菌內毒素、微生物限度等均合格；用貯存36個月無酚紅M199所制備sIPV成品的pH、D抗原、蛋白含量、Vero細胞DNA殘留量、牛血清白蛋白殘留量、Vero細胞蛋白殘留量、游離甲醛含量等各項檢定結果均符合中國藥典2020年版三部和企業標準要求；用貯存36個月無酚紅M199制備的sIPV效價合格、穩定性良好且與遠效期無酚紅sIPV免疫原性趨勢一致，效力（t =-0.15~2.17，P＞0.05）和誘導中和抗體水平（t =-1.46~2.02，P＞0.05）差異均無統計學意義。

結論用貯存至36個月的無酚紅M199制備的sIPV成品穩定性較好，近效期和遠效期無酚紅M199制備的sIPV產品質量屬性、免疫原性及穩定性趨勢一致，且對產品質量無影響，無酚紅培養基的效期初步可定為36個月。

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正文

Sabin株脊髓灰質炎（脊灰）滅活疫苗（Sabin strain inactivated poliomyelitis vaccine，sIPV）是目前預防脊灰最安全有效的疫苗，多年臨床研究數據表明其具備良好的安全性和免疫原性。M199培養基是sIPV生產過程中的關鍵物料，用于細胞傳代培養、半成品配制等工藝過程，在制劑階段起重要的穩定劑和保護劑作用，其質量屬性及效期等對疫苗產品質量有重要的影響。M199培養基一般添加酚紅作為酸堿指示劑，而酚紅為疫苗非目標成分。近年來，對疫苗終產品中雜質和防腐劑的規定越來越嚴格，用無酚紅培養基代替有酚紅培養基成為業界共識。然而，用無酚紅M199培養基生產sIPV時，其效期及無酚紅sIPV成品的質量屬性均需驗證。本研究通過驗證3批無酚紅M199的貯存效期，比較用遠效期及近效期無酚紅M199制備的sIPV的質量屬性、穩定性及免疫原性，綜合評價無酚紅M199的質量屬性，明確無酚紅M199培養基效期對產品質量的影響，為研究無酚紅培養基的貯存效期以及無酚紅sIPV成品質量屬性提供初步依據。

1

材料與方法

1.1

主要試劑

無酚紅M199培養基（Rf1：Gibco批號2299574、Rf2：Gibco批號2299576、Rf3：Gibco批號2286073）購自美國Gibco公司；sIPV Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型D抗原含量測定試劑盒，Vero細胞殘余蛋白檢測試劑盒，Ⅱ型脊灰疫苗病毒滴定質控品來自北京生物制品研究所有限責任公司（北京公司）；細菌內毒素工作標準品購自廈門鱟試劑生物科技股份有限公司；Vero細胞DNA工作參考品、Hep-2細胞、蛋白含量測定國家標準品（非人用）及Ⅰ、Ⅲ型脊灰疫苗病毒滴定國家參考品購自中國食品藥品檢定研究院。

1.2

實驗動物

無特定病原體級Wistar大鼠，410只，雌雄各半，體質量170~200 g，購自斯貝福（北京）生物技術有限公司，動物飼養許可證號：SYXK（京）2020-0031。

1.3

無酚紅M199干粉培養基的長期穩定性物理化學（理化）性質及微生物指標監測

將Rf1、Rf2、Rf3無酚紅M199干粉培養基貯存于2~8 ℃，于0、6、12、18、24、30、36及42個月時取樣，按照中國藥典2020年版三部（藥典三部）要求以及培養基質量企業標準（企標）檢定，檢測外觀、澄清度、pH、干燥失重、細菌內毒素、微生物限度等項目。

1.4

sIPV原液及成品制備

sIPV單價原液由北京公司經病毒培養、收獲、濃縮純化及滅活等工藝制備。分別將遠效期和近效期（貯存36個月并檢定合格）的Rf1、Rf2、Rf3無酚紅M199干粉培養基按比例溶解配制成無酚紅M199溶液，取各型別sIPV單價原液超濾離心（1 958×g離心5 min），分別加入Rf1、Rf2、Rf3無酚紅M199溶液，反復3次，置換成無酚紅sIPV單價原液，然后按比例配制成無酚紅sIPV成品。遠效期無酚紅制備sIPV批號為M1—M3，近效期批號為A1—A3。

1.5

近效期無酚紅sIPV成品穩定性考察

1.5.1　37 ℃加速穩定性將A1—A3批無酚紅sIPV成品取樣貯存于37 ℃條件下，第0、3、7、14、21、28天檢測Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型D抗原含量，與無酚紅sIPV成品歷史批次（批號：B1—B3）數據比較，分析2組成品穩定性趨勢。

1.5.2　25 ℃長期穩定性將A1—A3批無酚紅sIPV成品取樣貯存于25 ℃條件下，第0、2、4、6、8、10、12周檢測Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型D抗原含量，與B1—B3批數據比較，分析2組成品穩定性趨勢。

1.5.3　D抗原含量按照藥典三部通則3429相關要求，采用ELISA檢測各時間點的sIPV關鍵指標D抗原含量。將系列稀釋10、20、40、80、160、320倍的標準品和稀釋適宜濃度的供試品，與包被抗體于37 ℃反應1 h后，洗板，加入檢測抗體。按照常規ELISA步驟操作，反應結束后加入底物顯色終止，測定吸光度（A450/630）值，用系列稀釋的標準品D抗原濃度及其對應的A450/630值作標準曲線，計算供試品D抗原含量。以時間為橫坐標，檢測值為縱坐標，繪制D抗原趨勢圖。

1.6

近效期無酚紅sIPV成品和歷史成品批次各項指標檢測比較

分別對A1—A3和B1—B3批無酚紅sIPV成品，按照藥典三部以及注冊企標要求檢測pH、D抗原、蛋白質含量、Vero細胞DNA殘留量、牛血清白蛋白殘留量、Vero細胞蛋白殘留量、游離甲醛含量。

1.7

遠效期和近效期無酚紅sIPV成品免疫效果評價

1.7.1　效力檢測按照藥典三部通則3534相關要求，將M1—M3和A1—A3批無酚紅sIPV成品（供試品）與參考疫苗（經全項檢定合格并經標定使用）進行1、3、9、27倍系列稀釋后，經后腿肌內注射，分別免疫Wister大鼠（雌雄各半），每個稀釋度10只，0.5 mL/只。第21天經眼球采全血，5 000×g離心10 min，分離收集血清，于56 ℃滅活30 min。檢測大鼠血清中針對各型脊灰病毒的中和抗體并分別計算其半數有效劑量（median effective dose，ED50），計算供試品各型別的相對效力。供試品各型別ED50應不低于參考品。

1.7.2　中和抗體檢測分別用M1—M3和A1—A3批無酚紅sIPV成品免疫大鼠，每組10只。分別于第0、21、42天共進行3次免疫，每次肌內注射0.5 mL/只。第21、42天和第3次免疫后21 d（第63天）經眼眶采全血，5 000×g離心10 min，分離收集血清。采用微量細胞病變法測定大鼠中和抗體水平。將待檢血清1∶4稀釋，于56 ℃滅活30 min，在96孔細胞板中加入待檢血清，2倍系列稀釋到所需稀釋度，每份血清同時平行接種2孔，分別加入sIPV Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型稀釋成2 000 CCID50/mL攻擊用病毒，同型血清加入同型病毒液，每孔0.05 mL。混勻后于35 ℃ 5% CO2培養箱中和3 h，接種（1.0~2.5）×105 mL-1的細胞懸液0.1 mL，混勻后置于35 ℃ 5% CO2培養箱，7 d判定結果。以病毒回滴結果在640~6 400 CCID50/mL時試驗成立。孔內細胞完全病變記作陽性，無病變記作陰性，以Karber法計算中和終點，即能保護50%細胞不受100 CCID50/0.05 mL攻擊病毒感染的血清最高稀釋度為該血清的抗體滴度。中和抗體效價≥1∶4為陽性，＜1∶4為陰性。

1.8

統計學分析

采用Excel 2013軟件進行t檢驗，比較A1—A3批與B1—B3批sIPV中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型脊灰病毒D抗原含量，A1—A3與M1—M3批sIPV免疫Wistar大鼠的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型血清中和抗體幾何平均滴度（geometric mean titer，GMT）水平，以及A1—A3批與B1—B3批sIPV中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型脊灰病毒D抗原含量的穩定性數據，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2

結果

2.1

無酚紅干粉培養基長期理化性質監測

結果顯示，無酚紅干粉培養基Rf1—Rf3貯存于2~8 ℃至42個月，定性結果指標外觀為類白色固體粉末，澄清度為溶液澄清。貯存不同時間的培養基pH均在4.4~4.8，干燥失重不高于5%，細菌內毒素不高于10 內毒素單位（endotoxin unit，EU）/mL，需氧菌總數不高于200 CFU/g，霉菌及酵母菌總數不高于50 CFU/g，均符合藥典三部相關要求及原輔料企標。定量指標結果見表1。

2.2

近效期無酚紅sIPV成品穩定性評價

2.2.1　37 ℃加速穩定性貯存在37 ℃條件下，A1—A3批sIPV中Ⅰ型D抗原含量在7 d內不低于12 D抗原單位（D antigen unit，DU）/劑，Ⅱ型D抗原含量在28 d內不低于36 DU/劑，Ⅲ型D抗原含量在28 d內不低于32 DU/劑，符合藥典三部和企標要求。A1—A3與B1—B3批sIPV的Ⅰ型D抗原含量降解趨勢線斜率均值分別為-1.733和-1.419，Ⅱ型分別為-1.781和-1.391，Ⅲ型分別為-2.229和-2.390，各型37 ℃加速穩定性變化差異均無統計學意義（t值分別為-1.65、-2.22、0.54，P值分別為0.173、0.091、0.615），加速穩定性趨勢一致（圖1）。

2.2.2　25 ℃長期穩定性室溫條件下，A1—A3批sIPV中Ⅰ型D抗原含量在8周內不低于12 DU/劑，Ⅱ型D抗原含量在12周內不低于36 DU/劑，Ⅲ型D抗原含量在12周內不低于32 DU/劑，符合藥典三部和企標要求。A1—A3批與B1—B3批sIPV的Ⅰ型D抗原含量降解趨勢線斜率均值分別為-1.179和-0.893，Ⅱ型分別為-1.131和-1.000，Ⅲ型分別為-1.869和-1.917，各型室溫穩定性變化差異均無統計學意義（t值分別為-1.43、-0.65、0.26，P值分別為0.226、0.551、0.811），長期穩定性趨勢一致（圖2）。

2.3

近效期無酚紅sIPV成品質量屬性

2.3.1　D抗原含量A1、A2、A3批sIPV的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型D抗原平均含量分別為16、46、47 DU/劑，B1、B2、B3批sIPV分別為15、45、47 DU/劑。經t檢驗分析，2組樣品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型D抗原平均含量差異均無統計學意義（t值分別為2.12、1.06、0.38，P值分別為0.101、0.349、0.725）。

2.3.2　其他指標A1—A3批sIPV的pH均值為7.1，蛋白含量均值為2.1 μg/劑，Vero細胞蛋白殘留量均＜6 μg/劑，牛血清白蛋白殘留量均＜1 ng/劑，Vero細胞DNA殘留量均＜50 pg/劑，游離甲醛含量均＜ 0.5 μg/劑。B1—B3批sIPV pH均值為7.0，蛋白含量均值為2.1 μg/劑，Vero細胞蛋白殘留量均＜6 μg/劑，牛血清白蛋白殘留量均＜1 ng/劑，Vero細胞DNA殘留量均＜50 pg/劑，游離甲醛含量均＜0.5 μg/劑。各檢測項目的檢測結果均符合藥典三部相關要求及企標的要求。

2.4

遠效期和近效期無酚紅sIPV成品免疫效果分析

2.4.1　效力A1—A3和M1—M3批sIPV的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型大鼠效力試驗ED50均值分別為4.75、3.73、4.08和4.79、4.03、4.35，相對效力分別為1.21、1.24、1.22和1.22、1.20、1.11。近效期組與遠效期組的大鼠血清Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型陽轉率均達到100%。經t檢驗分析，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型相對效力差異均無統計學意義（t值分別為-0.15、0.89、2.17，P值分別為0.888、0.424、0.096），表明貯存36個月后無酚紅M199對產品效價無影響。

2.4.2　免疫原性A1—A3和M1—M3批sIPV組的一免陽轉率均為100%，免疫后抗sIPV Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型中和抗體的GMT均顯著上升（圖3），中和抗體水平差異無統計學意義（t值分別為-1.46、2.02、0.03，P值分別為0.219、0.113、0.976）。結果表明，近效期與遠效期無酚紅sIPV免疫原性趨勢一致，且均有較好的免疫原性。

3

M199培養基作為sIPV重要的穩定劑和保護劑，其含有的氨基酸和緩沖液等能夠穩定抗原結構，維持制劑的穩定，對產品質量有至關重要的作用。在sIPV制劑中，用無酚紅M199替換含有酚紅的M199，以去除制劑中可能干擾生物檢測的非目標成分酚紅，需要對成品的理化性質、有效性及效期等進行進一步的驗證。

本研究結果顯示，無酚紅M199貯存0至42個月的長期理化性質及微生物指標均合格，各項指標穩定。用貯存36個月并檢定合格的無酚紅M199制備的sIPV放行檢測項目均合格。D抗原作為關鍵有效抗原能刺激機體產生抗體，其含量與體內免疫原性有較好的一致性。本研究還拓展研究了無酚紅sIPV的穩定性及免疫原性，證實使用近效期與遠效期無酚紅M199制備的sIPV質量屬性一致、穩定性趨勢一致，均能誘導大鼠產生針對Sabin株脊灰病毒的中和抗體，表明貯存36個月后無酚紅培養基制備的sIPV成品仍具有較好的免疫原性，與文獻[10-12]報道一致。本研究證實，用近效期即貯存36個月的無酚紅M199制備的sIPV成品有效且質量可控，為無酚紅M199制備sIPV成品的質量屬性控制提供了初步研究依據。

作者

劉英微1 劉哲宇2 田東陽1 李建新3 張萌3 李娜4

1北京生物制品研究所有限責任公司課題一組， 北京 100176；2北京生物制品研究所有限責任公司質量檢定室， 北京 100176；3北京生物制品研究所有限責任公司疫苗五室， 北京 100176；4北京生物制品研究所有限責任公司質量保證部， 北京 100176

引用本文：劉英微, 劉哲宇, 田東陽, 等. 用于Sabin株脊髓灰質炎滅活疫苗生產的無酚紅M199培養基貯存效期驗證 [J].國際生物制品學雜志, 2025, 48(1): 20-25.

DOI: 10.3760/cma.j.cn311962-20240223-00009

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撰寫| 國際生物制品學雜志

校稿| Gddra編審| Hide / Blue sea

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