L-高絲氨酸是一種非蛋白質氨基酸，雖然它不參與蛋白質的合成，但在食品、飼料、化妝品及制藥行業中有著廣泛的應用。它不僅是合成多種化合物的關鍵前體，還因其與草銨膦（一種廣泛使用的除草劑）的化學結構相似，為綠色生物制造活性L-草銨膦提供了新的可能。

傳統上，L-高絲氨酸主要通過化學合成生產，但這種方法存在產量低、使用危險化學品和環境污染等問題。因此，研究人員開始探索利用微生物發酵來生產L-高絲氨酸，尤其是利用谷氨酸棒桿菌（Corynebacterium glutamicum）這一“細胞工廠”。谷氨酸棒桿菌在氨基酸發酵領域有著悠久的歷史，尤其是在生產 L-谷氨酸和L-賴氨酸方面表現出色。然而，野生型的谷氨酸棒桿菌并不能高效積累L-高絲氨酸。

為了突破這一限制，近日，中國科學院天津工業生物技術研究所的徐寧團隊和東北農業大學生命科學學院的姜巨全團隊合作，在 ACS Sustainable Chemistry & Engineering 上發表了一項題為“Metabolic Engineering of Corynebacterium glutamicum for Efficient LHomoserine Production from Lignocellulose-Derived Sugars”的研究，通過代謝工程改造谷氨酸棒桿菌，高效利用木質纖維素衍生糖生產L-高絲氨酸。

L-高絲氨酸的合成途徑始于 L-天冬氨酸，經過三步反應生成，涉及三個關鍵基因：lysC、asd 和 hom。研究人員首先通過基因編輯技術精準敲除了 thrB 基因，阻斷了 L-高絲氨酸的降解途徑，構建了基礎生產菌株 THC1。接著，他們對 lysC 和 hom 基因進行了定點突變（lysC 的 T311I 突變和 hom 的 G378E 突變），并過表達這些基因，有效緩解了反饋抑制，使得更多的碳代謝流向 L-高絲氨酸的合成。

為了進一步提升產量，研究人員還敲除了 alaT 和 ddh 基因，減少了 L-丙氨酸和 L-賴氨酸等副產物的生成。此外，他們還引入了來自大腸桿菌的 rhtB 基因，強化了 L-高絲氨酸的外排能力，減少了胞內產物積累對合成途徑的抑制。通過這些基因工程手段，研究人員成功構建了一個高效生產 L-高絲氨酸的菌株。

圖 | L-高絲氨酸的生物合成途徑及菌株改造效果

不過，研究人員發現，在谷氨酸棒桿菌株合成 L-高絲氨酸的過程中，原料葡萄糖主要通過磷酸烯醇式丙酮酸：糖磷酸轉移酶系統（PTS）被攝取。PTS 系統雖然高效，但它會消耗大量的磷酸烯醇式丙酮酸（PEP），影響碳代謝流的分配，進而限制菌株對于，L-高絲氨酸的合成。

為了解決這一問題，研究人員探索了非 PTS 依賴的葡萄糖攝取系統。通過過表達肌醇滲透酶（如 iolT1）和葡糖激酶（如來自枯草芽孢桿菌的 Bsglk 基因與 ppgK 基因），菌株利用非 PTS 途徑攝取葡萄糖并進行磷酸化的能力得到了明顯增強。同時，他們還對 iolT1 基因的啟動子進行了改造，解除了 IolR 蛋白對其表達的抑制，最終顯著提高了菌株在葡萄糖為碳源時的生長性能和 L-高絲氨酸產量。

圖 | 谷氨酸棒桿菌中葡萄糖的攝取和利用途徑

研究人員還引入了異源的 NADP 依賴的甘油醛-3-磷酸脫氫酶（如來自釀膿鏈球菌的 SpgapN）或 Entner-Doudoroff（ED）途徑（如來自希瓦氏菌的 SoED 途徑）。這些改造有效增加了胞內 NADPH 的供應，為 L-高絲氨酸的合成提供了充足的還原力，進一步提升了產量。

除了葡萄糖，木糖和纖維二糖也是木質纖維素水解產物中的重要成分。然而，野生型谷氨酸棒桿菌無法利用木糖。為了拓展其碳源利用范圍，研究人員將來自大腸桿菌的 xylA 基因（編碼木糖異構酶）和谷氨酸棒桿菌自身的 xylB 基因（編碼木酮糖激酶）導入菌株，并通過核糖體結合位點（RBS）工程對這兩個基因的表達進行精細調控。經過篩選，研究人員獲得了能夠高效利用木糖的菌株，其中攜帶優化表達 xylA 和 xylB 基因的 P#70 質粒的菌株表現最為突出。不僅如此，研究人員還通過分泌和表面展示策略，成功實現了對纖維二糖的有效利用。他們將來自嗜熱裂孢菌的 β-葡萄糖苷酶（BGL）與谷氨酸棒桿菌的 porin 蛋白和信號肽融合，在不同強啟動子的驅動下，增強 BGL 的分泌和表面定位。實驗結果表明，融合 CgR0949 信號序列和 Tfu_0937 的菌株在纖維二糖為碳源時生長良好，且能夠積累一定量的 L-高絲氨酸。

圖 | 改造菌株在 5L 發酵罐中混合糖發酵的性能評估

最終，為了驗證改造后的菌株在實際生產中的表現，研究人員將整合了多種優化策略的 THC14 菌株在 5L 補料分批生物反應器中進行發酵實驗，模擬木質纖維素衍生糖類的發酵過程。結果顯示，THC14 菌株在利用葡萄糖、木糖和纖維二糖時均能高效生產 L-高絲氨酸。

而在混合糖發酵中，L-高絲氨酸產量達到了 93.1 g/L，產率為 0.41 g/g，生產速率為 1.29 g/L/h。這一成果代表了目前谷氨酸棒桿菌生產 L-高絲氨酸的最高水平，為 L-高絲氨酸的工業化生產提供了新的技術方案。

參考文獻：

1.https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acssuschemeng.4c07838

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