作為一種天然倍半萜類化合物，α-紅沒藥烯因其獨特的香氣、顯著的抗氧化性，在醫藥和化妝品領域有著廣闊的應用前景。然而在 α-紅沒藥烯的生產過程中，傳統的植物提取法原料有限、提取效率低下，提取工藝也復雜，大大增加了生產成本。

在這種背景下，微生物發酵技成為生產 α-紅沒藥烯的理想選擇。其中，釀酒酵母不僅具備內源的甲羥戊酸（MVA）代謝途徑，其能夠利用葡萄糖獨立合成 α-紅沒藥烯的關鍵前體物質法尼基焦磷酸（FPP），而且釀酒酵母的遺傳操作相對簡便，發酵過程易于控制，為大規模生產 α-紅沒藥烯提供了可能。

圖|代謝工程改造的釀酒酵母菌株生產 α-紅沒藥烯的過程

不過，在實際應用過程中，釀酒酵母生產 α-紅沒藥烯仍面臨著一個難題，即難以精準把握細胞生長與產物合成之間的平衡——過早激活產物合成途徑會抑制酵母菌生長，而延遲啟動則會降低其生產效率。此外，代謝負擔也會限制細胞的生長，進而影響 α-紅沒藥烯的產量。

為了解決這一問題，北京化工大學王萌教授團隊近日于 ACS Synthetic Biology 發表了一篇題為“Developing Thermosensitive Metabolic Regulation Strategies in the Fermentation Process of Saccharomyces cerevisiae to Enhance α-Bisabolene Production”的研究，研究團隊利用強化前體供應、溫度敏感調控、發酵培養基優化等多項策略，成功構建了高產 α-紅沒藥烯的釀酒酵母，最終，在補料分批發酵中的產量高達 18.6g/L，這是迄今為止報道的最高產量，為工業規模萜烯生物合成帶來了新的途徑。

為了增強 α-紅沒藥烯生產的前體 FPP 的供應途徑，研究人員過表達了 MVA 途徑中從乙酰輔酶 A 到 FPP 的相關內源基因，包括 ERG10、ERG13、tHMG1、ERG12、ERG8、MVDI、IDI 和 ERG20 等，構建了一系列工程菌株。結果表明，隨著整合基因數量的增加，FPP 的產量也顯著提高。最終，經過全面代謝途徑增強的菌株 BFSC0001 在 FPP 產量上達到了 264.8 ng/mL，是起始菌株 5DΔ 的 44.9 倍。其在搖瓶中 96 h 后 α-紅沒藥烯的滴度達 139.9 mg/L。

不過，僅增強 FPP 的供應并不足以實現 α-紅沒藥烯的高效生產。研究人員進一步發現，α-紅沒藥烯合成酶（Ag1）的活性有限，無法將所有 FPP 轉化為 α-紅沒藥烯，導致 FPP 的積累。

他們引入了溫度敏感型的 GAL4M9 來替代 GAL 調控 Ag1 的表達，從而實現溫度依賴的基因表達。在較高溫度（如 30℃）下，細胞能夠充分生長并積累足夠的生物量；而在較低溫度（如 26℃）下，目標基因的表達被激活，從而促進 α-紅沒藥烯的合成。這種兩階段發酵策略不僅減少了中間代謝產物對細胞生長的負面影響，還顯著降低了代謝負擔，實現了生物量和產物積累的雙重提升。

圖| 通過調控 GAL 啟動子，實現在 30℃ 促進細胞生長、26℃ 激活基因轉錄

為了提高 α-紅沒藥烯的產量，團隊對啟動子進行了優化，最終確定了 pCYC1 啟動子在 30℃/26℃ 兩階段發酵條件下表現最佳，使 α-紅沒藥烯的產量達到了 216 mg/L，相比單一30℃ 發酵的起始菌株提高了 56.5%。

此外，為了進一步優化α-紅沒藥烯的發酵生產，研究人員還借助了代謝組學分析。他們通過在發酵培養基中添加不同濃度的氨基酸，發現添加外源精氨酸、蛋氨酸、谷氨酸、絲氨酸和天冬氨酸等氨基酸能夠顯著促進細菌生長，并提高 α-紅沒藥烯的產量。特別是當添加 100 mg/L 的 D-泛酸鈣時，α-紅沒藥烯的產量增加了 55.6%。這是因為 D-泛酸鈣作為輔酶 A 的前體，對 α-紅沒藥烯合成的關鍵前體物質乙酰輔酶 A 的合成起到了關鍵作用。通過響應面模型分析，研究人員還確定了最佳發酵培養基的組成，包括 20 g/L 的葡萄糖、15 g/L 的硫酸銨和 6.25 g/L 的七水硫酸鎂。在這些優化條件下，α-紅沒藥烯的產量在搖瓶發酵中達到了 658 mg/L，比未優化的基本發酵培養基提高了 98.3%。

圖|研究人員探究不同發酵培養條件對 α-紅沒藥烯產量影響

為了驗證構建的 α-紅沒藥烯釀酒酵母平臺菌株在實際工業化生產的應用效果，研究人員在 2.5 L 和 30 L 的生物反應器中進行了補料分批發酵實驗。通過精確控制發酵過程中的 pH 值、攪拌速度等參數，最終在 2.5 L 生物反應器中實現了 18.6 g/L 的 α-紅沒藥烯產量，這是迄今為止報道的最高產量。在 30 L 生物反應器中，盡管產量略有下降，但仍然達到了 17.5 g/L。這些結果表明，通過溫度敏感型調控策略、代謝通量優化和發酵條件的精細調整，利用酵母菌發酵高效生產 α-紅沒藥烯并實現大規模工業化有著良好的前景。

參考文獻：

1.https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acssynbio.4c00728

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