類器官（Organoid）已成為生命科學和醫學研究領域的“明星模型”，在疾病機制研究、藥物篩選、精準醫療等方面展現出巨大潛力。然而，許多科研人員在嘗試類器官培養時，常常面臨“無法形成結構”、“細胞活性低”、“傳代失敗”等問題。

探究其根本，培養體系中細胞因子的選擇和配比可能是成敗的關鍵！

接下來，我們將會結合類器官經典培養方案WENR（Wnt3a、EGF、Noggin、R-Spondins），解析“四大護法”如何各顯神通，助你攻克類器官培養難關！

類器官的經典培養方案WENR（或稱為WNER）最初由類器官之父、荷蘭Hubrecht研究所的Hans Clevers教授團隊開發，其核心成分包括 Wnt-3a、EGF、Noggin 和 R-Spondins，常被稱為類器官培養的“四大護法”。

WENR 方案在類器官的研究與實踐中不斷演化，通過與其他細胞因子或小分子抑制劑的巧妙結合，衍生出適用于多種類器官構建的培養條件。目前，WENR 方案已在胃、小腸、結腸、胰腺、肝臟等多種類器官培養中得到廣泛應用。

WENR方案用于多種類器官培養（源自Bindi M. Doshi, PhD. www.labroots.com）

WENR“四大護法”

WENR 方案源于對干細胞微環境的深度解析。研究發現，腸道、肝臟、胰腺等器官的干細胞生態位中，Wnt 信號通路、EGF 信號通路、BMP 信號通路的動態平衡是維持干細胞自我更新與分化的關鍵。通過模擬這一微環境，科學家篩選出這四類核心因子。

WENR方案在肺類器官培養中的作用（源自文獻：doi: 10.3390/cancers14092144）

Wnt-3a：干細胞增殖的“發動機”

Wnt-3a 作為經典 Wnt 通路的激活劑，通過穩定 β-catenin 蛋白，啟動下游靶基因（如c-Myc、Cyclin D1），參與細胞發育、增殖和分化過程。Alessandra Merenda在其綜述中深入總結了Wnt信號通路在類器官領域的關鍵作用。文中指出，無論成體干細胞組織來源如何，其衍生的類器官在增殖、干性維持及終末分化特化細胞等關鍵環節，都依賴于經典 Wnt 信號通路。如在小鼠結腸類器官的建立過程中，添加外源性 Wnt-3a 對于其增殖至關重要。而不添加 Wnt-3a，類器官超過 3 天后無法存活。

Wnt-3a在腸類器官中培養中的作用（源自文獻：doi: 10.1016/j.tcb.2019.10.003）

EGF：細胞增殖的“加速器”

表皮生長因子（EGF）與受體結合，激活 MAPK/ERK 通路，促進細胞增殖和存活。EGF 刺激上皮細胞增殖、血管生成和表皮細胞分化，促進類器官三維結構的形成。EGF 廣泛應用于胃腸道、肝臟、甲狀腺等類器官培養，促進細胞集落形成和組織結構穩定性。盡管 EGF 并非類器官形成的必需因子，但能顯著增加類器官體積。

優化的WENR方案在人胃腸道類器官構建過程中的應用（源自文獻：doi: 10.1186/s13619-020-00040-w）

Noggin：抑制分化的“守門員”

Noggin是一種骨形態發生蛋白（BMP）的內源性抑制劑，通過阻斷 BMP 與受體結合，促進干細胞增殖，為類器官形成提供充足的細胞。Noggin 還通過抑制 BMP 信號通路，維持干細胞干性，影響細胞的命運決定和分化過程。在類器官培養中，Noggin 常與 Wnt-3a 和 R-Spondins 一起使用，以平衡 BMP 和 Wnt 信號通路，促進類器官的生長和分化。因此，Noggin 在類器官培養中不僅促進增殖，還精細調控細胞的分化。

Noggin抑制細胞增殖的分子機制（源自文獻：doi: 10.1242/bio.20149977）

R-Spondins：Wnt信號的“放大器”

R-spondin 是 Wnt 信號通路的激活劑，通過與 Frizzled 和 LRP5/6 受體結合，增強 Wnt 信號在多種組織中的表達，促進干細胞增殖與類器官結構形成。T. Thalheim等人發現，沒有 R-spondin 存在時，類器官在 4-5 天后停止生長。在 1.2% R-spondin 濃度下培養的類器官生長非常迅速，生長時間超過 5 天后經常破裂，其管腔內積累了大量細胞碎片。在 10% 或 25% 的 R-spondin 濃度下培養的類器官生長速度比 1.2% 稍慢，但不會破裂。

不同濃度的R-spondin影響腸類器官的生長狀態（源自文獻：doi: 10.1016/j.ydbio.2017.10.013）

WENR經典方案使用小Tips

Wnt 過度激活會導致類器官結構紊亂，因此 Wnt-3a 濃度需嚴格控制。并且 R-spondin 需要和 Wnt-3a 協同使用，單獨使用效果有限。建議根據類器官類型優化 Wnt-3a 的濃度，一般為 50-100 ng/mL。在培養后期也可以動態調控其濃度。

EGF 易被蛋白酶降解，建議使用無血清培養基。EGF 長期高濃度，可能會誘導異常分化，建議定期更換培養基。EGF 一般使用濃度為 50 ng/mL。在腫瘤類器官（如腸癌）中，其濃度需根據癌細胞特性調整。

Noggin 與 Wnt-3a 協同作用，支持胃、腸道、肝臟、肺、胰腺等類器官的長期培養。在肺類器官培養中，Noggin 缺失會導致肺泡上皮細胞過早分化。在肝類器官中，其與 Wnt3a 的“雙劍合璧”是長期傳代的關鍵。BMP 信號的過度激活會導致類器官形成囊狀結構，失去功能性隱窩結構。

R-spondin 有4個亞型（RSPO 1-4），不同組織來源的類器官可能需特異性選擇。Wnt-3a 和 R-spondin 易失活，建議分裝后 -80℃ 保存。

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參考文獻：

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