二巖藻糖基乳糖（Difucosyllactose，DFL）是母乳低聚糖（HMO）的重要組成部分，屬于最簡單的 HMO。研究已證實，DFL 是一種典型的巖藻糖基化 HMO，不僅能促進新生兒的生長發育，還具有重要的抗菌活性。鑒于這些功能性特點，DFL 已被 FDA 和歐洲食品安全局等認證并批準為新型食品添加劑或成分。

因此，如何更高效和安全生產 DFL 成為了當下的研究熱點。與其他方法相比，利用微生物細胞工廠合成 DFL 具有成本低、安全、快捷和環保等特點，有潛力成為大規模生產 DFL 的可行方法。目前 DFL 的微生物合成主要依賴質粒表達系統，但質粒穩定性差、抗生素依賴等問題制約了其工業化進程。

近日，江南大學沐萬孟團隊通過多維度代謝工程策略，成功構建出高效生產 DFL 的工程菌株 MGA2S-5。該菌株在 7 L 生物反應器中實現了 35.04 g/L 的 DFL 產量，且全程無需添加抗生素，為安全、穩定的工業化生產提供了新方案。相關成果以“Multidimensional Engineering of Escherichia coli MG1655 for the Efficient Biosynthesis of Difucosyllactose”為題發表于 Journal of Agricultural and Food Chemistry 。

研究團隊以無質粒大腸桿菌 MG1655 為底盤細胞，利用 CRISPR-Cpf1 基因編輯技術，將 α1,2-巖藻糖基轉移酶（SAMT）和 α1,3-巖藻糖基轉移酶（Fut3Bc）直接整合至染色體。SAMT 負責將乳糖轉化為中間體 2'-巖藻糖乳糖（2'-FL），Fut3Bc 則進一步催化 2'-FL 生成 DFL。通過消除質粒依賴，菌株的遺傳穩定性顯著提升，同時避免了抗生素使用帶來的安全風險。

圖 | 工程化大腸桿菌 MG1655 中 DFL 的從頭生合成途徑

研究進一步優化了基因拷貝數配比，以平衡代謝流的分配。實驗表明，染色體中插入 2 拷貝 SAMT 與 4 拷貝 Fut3Bc 突變體（F24Y）時，代謝流分配最為均衡。此配置不僅減少了中間產物 2'-FL 的積累，還將 DFL 產量最大化。最終菌株 MGA25-5 在搖瓶發酵中，DFL 產量達 4.00 g/L，較未優化菌株提升近 4.9 倍。

盡管基因組整合解決了質粒穩定性問題，但野生型Fut3Bc的催化效率仍是限速步驟。Fut3Bc 負責催化 2'-FL的 C3 位巖藻糖基化反應，而野生型 Fut3Bc 在底物結合與催化活性上仍有優化空間。因此，研究團隊結合 AlphaFold 3 結構預測與 HotSpot Wizard 活性位點分析，對 Fut3Bc 進行定向進化。通過丙氨酸掃描篩選出關鍵位點 Phe24（F24），該殘基與底物 2'-FL 形成關鍵氫鍵。飽和突變實驗發現，F24Y 突變體（苯丙氨酸突變為酪氨酸）能顯著增強底物結合能力，分子對接顯示 F24Y 突變使酶與底物的相互作用更穩定，同時優化了催化口袋的空間結構，其與2'-FL的結合能降低至 2.4 kJ/mol，催化效率較野生型提升 1.6 倍。

圖 | AlphaFold3 模擬的關鍵限速酶 Fut3Bc 的晶體結構

盡管研究團隊通過無質粒策略構建了工程菌株，并優化了關鍵酶 Fut3Bc（F24Y）的催化性能，但在初步發酵實驗中仍然發現了底物利用效率不均衡的問題：2'-FL 在某些條件下仍然會積累，而 DFL 的合成速率并未達到理論最優值。為此團隊從兩方面優化代謝網絡：其一，動態調控乳糖補料速率（2-3 g/L/h），避免 2'-FL 過量堆積；其二，強化 GDP-L-巖藻糖合成途徑，通過替換 manA、manB、manC、gmd 和 fcl 基因的天然啟動子為強啟動子（Ptac70 和 PJ23119），顯著提高了巖藻糖供體的供給效率。

在 7 L 生物反應器中，MGA25-5 展現出卓越性能：發酵 46.8 h 時 DFL 產量達 25.30 g/L，最終在 63.5 小時突破 35.04 g/L，生產效率為 0.66 g/L/h，且發酵液中未檢測到殘留中間產物。與既往研究相比，該菌株在產量、生產強度與產物純度上均實現突破。例如，質粒依賴型菌株 CS-10 雖曾報道 53.15 g/L 產量，但殘留 6.86 g/L 2'-FL，而 MGA25-5 在相同發酵時間內產量高出 35%，且完全消除副產物。這一結果表明，優化酶拷貝數、增強前體供應和精準調控底物投料，是提升 DFL 合成效率的關鍵策略，也為未來母乳低聚糖的高效生物合成提供了重要借鑒。

該研究通過多維工程策略，將無質粒合成生物學與計算機輔助設計相結合，為 DFL 的工業化生產提供了安全高效的技術路徑。未來團隊計劃進一步優化菌株的底物耐受性與魯棒性，并探索智能調控策略以適應更大規模發酵。此外，該平臺技術可擴展至其他高附加值母乳低聚糖（如 LNT、LNnT）的生物制造，為功能性食品與醫藥領域注入創新動力。

1.Chen Y, Zhao C, Wang R, Zhang W, Zhu Y, Mu W. Multidimensional Engineering of Escherichia coli

MG1655 for the Efficient Biosynthesis of Difucosyllactose. J Agric Food Chem. 2025;73(9):5405-5413. doi:10.1021/acs.jafc.4c12623

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