導(dǎo)讀

過繼轉(zhuǎn)移嵌合抗原受體（CAR）T細(xì)胞是一項(xiàng)強(qiáng)有力的技術(shù)，它徹底改變了免疫治療的方式。其在難治性和復(fù)發(fā)性血液系統(tǒng)惡性腫瘤中完全和長(zhǎng)期的療效令人印象深刻，這也為實(shí)體腫瘤的治療開辟了新的可能性。然而，細(xì)胞治療的廣泛應(yīng)用受到了T細(xì)胞轉(zhuǎn)染常用病毒載體自身局限的阻礙。在mRNA疫苗和CRISPR/Cas9精準(zhǔn)基因編輯的時(shí)代，新的無病毒T細(xì)胞工程化方法正在成為下一代CAR-T細(xì)胞制造的更通用、靈活和可持續(xù)的替代方法。

困局突圍：病毒載體的阿喀琉斯之踵

迄今為止，臨床試驗(yàn)中批準(zhǔn)或研究的大多數(shù)CAR-T細(xì)胞治療都是利用病毒載體，特別是逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒載體。病毒載體是具有高效基因轉(zhuǎn)移和長(zhǎng)期應(yīng)用歷史的標(biāo)準(zhǔn)化系統(tǒng)，已經(jīng)證明了在過繼性T細(xì)胞治療的安全性。

然而，病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)長(zhǎng)基因的能力受到衣殼的限制。病毒衣殼直徑大約為100nm，通常不能容納超過8-9 kb的基因。然而，隨著CAR-T技術(shù)的更新迭代，需要轉(zhuǎn)入額外的激活原件或者不同特異性的CAR，實(shí)現(xiàn)更高的藥效、安全性和適用性。

此外，臨床應(yīng)用的病毒生產(chǎn)通常需要兩到三周的時(shí)間，在GMP條件下和生物安全2級(jí)（BSL2）設(shè)施中進(jìn)行，需要經(jīng)過熟練培訓(xùn)的員工。這種高成本、復(fù)雜性以及個(gè)性化治療的需要最終影響了CAR-T產(chǎn)品的價(jià)格，可能達(dá)到每人數(shù)十萬美元，使普通的患者望而生畏。

最后，病毒載體具有固有的免疫原性風(fēng)險(xiǎn)，這是由對(duì)載體編碼表位的體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)引起的，這可能限制轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的效力和持久性。

破冰利器：非病毒CAR-T工程化平臺(tái)解析

睡美人轉(zhuǎn)座子

與病毒系統(tǒng)相比，這種策略的一大優(yōu)勢(shì)是更大的裝載能力。插入物的大小與轉(zhuǎn)座機(jī)制的效率呈負(fù)相關(guān)。最佳裝載大小不高于6kb。但其升級(jí)版本包括兩個(gè)完整的轉(zhuǎn)座子單元，可以將負(fù)載增加到11kb，從而擴(kuò)充了基于SB載體的克隆能力。此外，當(dāng)與細(xì)菌人工染色體（BACs）結(jié)合時(shí)，SB在人類胚胎干細(xì)胞中可以傳遞高達(dá)100 kb的轉(zhuǎn)基因。

在臨床應(yīng)用方面，Cooper等人的團(tuán)隊(duì)首次將SB工程化抗CD19 CAR-T細(xì)胞應(yīng)用于臨床試驗(yàn)，兩項(xiàng)臨床試驗(yàn)（NCT00968760、NCT01497184）證實(shí)了SB工程化抗CD19 CAR-T細(xì)胞在26例B-ALL和非霍奇金淋巴瘤患者自體或異基因造血干細(xì)胞移植（HSCT）后作為輔助治療的安全性。

PiggyBac轉(zhuǎn)座子

與SB載體一樣，PB系統(tǒng)由PB轉(zhuǎn)座酶（PBase）構(gòu)成，其形式為mRNA或DNA，以及攜帶所需基因的單獨(dú)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒。PB在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中具有比SB更高的轉(zhuǎn)座子動(dòng)員轉(zhuǎn)座活性，比病毒載體具有更大的裝載能力（高達(dá)14 kb），并允許通過設(shè)計(jì)多順反子盒進(jìn)行多個(gè)轉(zhuǎn)基因傳遞。

在澳大利亞開展的CARTELL試驗(yàn)是一項(xiàng)I期臨床研究（ACTRN12617001579381），旨在研究通過PB轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)獲得的供體衍生抗CD19 CAR-T細(xì)胞的療效和安全性。早期結(jié)果表明，其活性類似于用高應(yīng)答率病毒載體生成的抗CD19 CAR-T細(xì)胞。另外，分別在日本（UMIN000030984）和中國(guó)（NCT04289220）進(jìn)行的兩項(xiàng)I期研究正在調(diào)查使用PB系統(tǒng)制造的抗CD19 CAR-T細(xì)胞的可行性和安全性。在日本的研究中，到目前為止，沒有一名患者顯示出劑量限制性毒性。一名患者表現(xiàn)出持續(xù)9個(gè)月的B細(xì)胞再生障礙。

mRNA

RNA適合多種細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法，包括電穿孔、陽(yáng)離子脂質(zhì)和陽(yáng)離子聚合物。已經(jīng)有許多體外和體內(nèi)臨床前研究，通過mRNA將CAR引入T細(xì)胞，用于在血液腫瘤和實(shí)體瘤的模型系統(tǒng)中進(jìn)行測(cè)試。雖然基于mRNA的治療被證明可以減少靶向效應(yīng)、降低毒性并緩解整合相關(guān)的安全性問題，但蛋白質(zhì)表達(dá)的瞬時(shí)性在這些應(yīng)用中也是一個(gè)缺點(diǎn)。

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技術(shù)創(chuàng)新：多學(xué)科交叉突破

納米載體

為了應(yīng)對(duì)未來的挑戰(zhàn)，除了轉(zhuǎn)座子平臺(tái)外，基因工程的另一個(gè)非病毒工具是納米載體，納米載體的使用正在成為一種可能的解決方案，以克服目前基因傳遞中的障礙，例如毒性和低轉(zhuǎn)染效率。

在納米技術(shù)的最新進(jìn)展中，作為最前沿的發(fā)現(xiàn)之一，Bozza等人開發(fā)了一種非整合DNA納米載體，能夠生成在體外和體內(nèi)都具有活性的CAR-T細(xì)胞。該平臺(tái)不含病毒成分，能夠在分裂細(xì)胞的細(xì)胞核中進(jìn)行額外的染色體復(fù)制，在不需整合的情況下維持持續(xù)的轉(zhuǎn)基因表達(dá)。此外，它還具有非病毒載體的所有優(yōu)點(diǎn)：非免疫原性、簡(jiǎn)單、多功能且生產(chǎn)成本低廉。

新型生物材料

另一方面，通過使用開發(fā)的新型生物材料來改善CAR-T細(xì)胞的分離、激活和基因修飾，正在取得進(jìn)展。一個(gè)例子是使用合成DNA適配體和互補(bǔ)逆轉(zhuǎn)技術(shù)，允許從PBMC中分離出高純度和高產(chǎn)量的無標(biāo)記CD8+T細(xì)胞。這種方法的最大優(yōu)點(diǎn)是可以通過具有不同特異性的適配體在單個(gè)分離步驟中分離多個(gè)不同的T細(xì)胞群。

基因編輯

基因編輯和靶向敲除分別依賴于宿主DNA雙鏈斷裂（DSB）修復(fù)和同源定向修復(fù)（HDR）過程，HDR通常在原代細(xì)胞中發(fā)生頻率較低，并且僅限于小的轉(zhuǎn)基因，導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率較低。為了更高效地提供DNA插入，CRISPR/Cas9最近與轉(zhuǎn)座子結(jié)合，以提高RNA引導(dǎo)整合的效率，使用轉(zhuǎn)座酶催化整合。為此，有研究小組進(jìn)行了將CRISPR/Cas9與SB轉(zhuǎn)座子結(jié)合的實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，它們適用于未來的非病毒臨床應(yīng)用。識(shí)別和降低基因組重排和易位風(fēng)險(xiǎn)的方法可以允許在免疫治療中進(jìn)一步開發(fā)基因編輯的潛在臨床應(yīng)用。

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結(jié)語(yǔ)：非病毒性CAR-T的星辰大海

迄今為止，成功的 CAR-T 細(xì)胞治療都與用病毒載體工程化的 T 細(xì)胞有關(guān)。 然而，復(fù)發(fā)、制造過程的復(fù)雜性以及這些技術(shù)在包括實(shí)體瘤在內(nèi)的其他疾病中的應(yīng)用，需要更復(fù)雜的設(shè)計(jì)和基因轉(zhuǎn)移技術(shù)來適應(yīng)這些挑戰(zhàn) 。 為了填補(bǔ)這些空白，非病毒技術(shù)正在不斷取得進(jìn)展，并正在改寫CAR-T療法的底層邏輯：從“天價(jià)特藥”走向“普惠醫(yī)療”，從血液瘤單點(diǎn)突破到全面攻克實(shí)體瘤與自身免疫病。盡管仍需克服持久性、工藝標(biāo)準(zhǔn)化等挑戰(zhàn)，但結(jié)合基因編輯、納米技術(shù)與合成生物學(xué)的發(fā)展，非病毒CAR-T有望在未來5-10年內(nèi)引領(lǐng)細(xì)胞治療進(jìn)入“工業(yè)化時(shí)代”。

參考文獻(xiàn)：

1.The Past, Present, and Future of Non-Viral CAR T Cells. Front Immunol.2022; 13: 867013.

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