尸胺（1,5-戊二胺）是一種天然的多胺類化合物，具備多種化學(xué)和生物活性，在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域可用于調(diào)節(jié)植物生長，在醫(yī)藥領(lǐng)域則可參與藥物合成等過程。同時，它還是重要的 C5 平臺化學(xué)品，是合成聚氨酯和生物聚酰胺（如尼龍）的關(guān)鍵單體。

近日，清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院陳國強教授團(tuán)隊于 Journal of Agricultural and Food Chemistry 發(fā)表了一項題為“Engineered Vibrio natriegens with a Toxin?Antitoxin System for High-Productivity Biotransformation of L-Lysine to Cadaverine”的重要成果。該團(tuán)隊借助工程手段對需鈉弧菌（Vibrio natriegens）進(jìn)行改造，將 L-賴氨酸高效轉(zhuǎn)化為尸胺，為工業(yè)生產(chǎn)尸胺提供了全新且有效的方法。

尸胺可以通過工程化微生物從多種碳源從頭合成，也可以通過工程化微生物的全細(xì)胞催化，從 L-賴氨酸一步合成。

在過往的研究中，大腸桿菌是生產(chǎn)尸胺的主要微生物底盤，然而由于大腸桿菌存在細(xì)胞膜通透性限制，使得底物和產(chǎn)物的轉(zhuǎn)運效率較低。相比之下，需鈉弧菌作為新一代工業(yè)生物技術(shù)的潛在底盤，具有著顯著優(yōu)勢，其生長速度極快，能在短時間內(nèi)達(dá)到較高的細(xì)胞密度。研究人員在對比需鈉弧菌和大腸桿菌對 L-賴氨酸的耐受性實驗中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)賴氨酸濃度達(dá)到 80 g/L 時，大腸桿菌會停止生長，而需鈉弧菌的細(xì)胞密度仍能達(dá)到未添加賴氨酸時的一半以上，表明需鈉弧菌對賴氨酸具有優(yōu)異的耐受性，這些特性使需鈉弧菌成為生物合成尸胺的理想候選菌株。

圖 | 兩種菌對賴氨酸耐受性差異及不同基因組合菌株的尸胺產(chǎn)量

野生型需鈉弧菌無法從頭合成尸胺，也無法將賴氨酸轉(zhuǎn)化為尸胺。因此研究人員首先將尸胺的合成途徑引入需鈉弧菌，構(gòu)建了多個攜帶不同基因組合的菌株。

其中兩種賴氨酸脫羧酶——CadA 和 LdcC 是生產(chǎn)尸胺最有前景的候選酶，通常需要輔因子磷酸吡哆醛（PLP）；CadA 的一個突變體 CadAM3（V12C 和 D41C 突變）表現(xiàn)出更好的 pH 穩(wěn)定性；CadB 是一種賴氨酸-尸胺反向轉(zhuǎn)運蛋白，在尸胺分泌和賴氨酸攝取中發(fā)揮雙重作用；LysP 是一種賴氨酸特異性滲透酶，有助于賴氨酸的攝取。

結(jié)果顯示，過表達(dá) CadAM3 的需鈉弧菌并未比過表達(dá)原始 CadA 的菌株產(chǎn)生更高的尸胺滴度。在一系列過表達(dá) CadA 的菌株中，額外過表達(dá)編碼 CadB、LysP 或兩者的基因顯著提高了尸胺的產(chǎn)量。最終攜帶 pSEVA341-pTac-ldcC 的需鈉弧菌被用于后續(xù)的深入研究，并探究最佳反應(yīng)條件為：在 0 小時初始添加 2 mg/L 的 IPTG，隨后在第 8 小時添加 60 g/L 的賴氨酸和 0.05 mM 的 PLP，維持培養(yǎng)環(huán)境在 pH 7 和 37°C。在 8 小時的催化過程中，其生成了 31.9 g/L 的尸胺，轉(zhuǎn)化率為 76.1%。

尸胺的分泌和賴氨酸的攝取在尸胺生物催化中發(fā)揮重要作用。研究中采用了兩種策略來優(yōu)化尸胺和賴氨酸的轉(zhuǎn)化。

第一種，研究人員致力于提高細(xì)胞膜通透性，以優(yōu)化賴氨酸和尸胺的轉(zhuǎn)運效率。他們研究了多種表面活性劑（如 SDS、Triton X-100、Tween 20）和有機溶劑（甲醇、乙醇）的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn) 0.2 mM 的 SDS 提升尸胺產(chǎn)量的效果最為顯著。

第二種策略與 LysE 有關(guān)，敲除 lysE 可以減少胞外賴氨酸的運輸，促進(jìn)胞內(nèi)賴氨酸的積累。其中 V. natriegens ΔPN96_RS17440 菌株的效果最為明顯，尸胺產(chǎn)量得到了明顯提升。

在上述優(yōu)化條件下，攜帶 pSEVA341-pTac-ldcC 的 V. natriegens ΔPN96_RS17440 在 0.2 mM SDS 存在下積累的尸胺滴度最高，達(dá)到 37.7 g/L，轉(zhuǎn)化率為 90.1%

圖 | 尸胺產(chǎn)量優(yōu)化策略

為進(jìn)一步提高尸胺的生產(chǎn)效率并降低成本，研究人員還將源自嗜鹽菌（Halomonas bluephagenesis）的hbpB/hbpC 毒素-抗毒素（TA）系統(tǒng)引入需鈉弧菌。

以 sfgfp（超折疊綠色熒光蛋白）為報告基因的實驗顯示，該系統(tǒng)顯著提高了質(zhì)粒穩(wěn)定性，增強了蛋白質(zhì)表達(dá)，增加了細(xì)胞密度。并且，由于無需使用抗生素，生產(chǎn)成本得以降低。

圖 | 利用 sfgfp 作為報告基因?qū)в卸舅?抗毒素系統(tǒng)的質(zhì)粒進(jìn)行表

利用攜帶毒素-抗毒素系統(tǒng)的 V. natriegens 進(jìn)行尸胺的全細(xì)胞催化。在 7 L 生物反應(yīng)器實驗中，攜帶 hbpBC TA 系統(tǒng)的菌株表現(xiàn)優(yōu)異。例如，V. natriegens ΔPN96_RS1744 菌株，攜帶 pSEVA341-pTac-ldcC-pHbpBC-hbpBC，尸胺產(chǎn)量達(dá)到 158 g/L，生產(chǎn)率為 14.4 g/L/h，相比原始菌株產(chǎn)量提高了 37%，且所有菌株的轉(zhuǎn)化率均保持在 90% 左右。

總之，通過基因編輯和導(dǎo)入毒素-抗毒素系統(tǒng)等手段，研究團(tuán)隊成功工程改造了需鈉弧菌，使其成為高效生產(chǎn)尸胺的優(yōu)質(zhì)底盤，并展示了需鈉弧菌在尸胺的生物制造上的巨大潛力。

參考文獻(xiàn)：

https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.jafc.4c12616

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