近年來，隨著代謝工程和合成生物學的快速發展，微生物細胞工廠（Microbial Cell Factories, MCF）已成為從可再生原料中高效生產化學品的重要平臺。鑒于開發高效的微生物細胞工廠面臨著復雜的技術挑戰和高昂的成本，人們開始嘗試通過計算生物學方法預測微生物細胞工廠高產所需的代謝工程改造靶點，以減少試錯成本。然而，現有的方法往往只能提供大量的候選基因靶點，缺乏對代謝網絡中酶活性和資源分配的綜合考慮，這使得實驗驗證過程繁瑣且效率低下。

在此背景下，上海交通大學魯洪中課題組聯合查爾姆斯理工大學、西北農林科技大學、中科院大連化學物理研究所等機構的研究人員聯合開發了一種細胞工廠設計新工具——ecFactory，該工具基于酶約束代謝模型（ecModel），可以預測提升不同種類化學品合成效率所需的代謝工程改造目標，并分析不同化合物間共有的基因改造靶點，為開發多功能平臺菌株指明了方向。同時，利用 ecModel，研究人員系統預測了釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中 103 種高價值化學品的代謝工程改造基因靶點及其最佳組合，助力酵母細胞工廠的全局優化研究。相關工作于近期發表于 PNAS。

這項工作中，為系統開展細胞工廠的理性設計，作者首先收集了釀酒酵母中可以合成的 103 種具有工業價值的化學品。根據化學特性，103 種化學品被分為 10 個家族，包括氨基酸、萜類化合物、有機酸等（圖 1）。對于其中相對于酵母底盤的 53 種異源產品，作者系統收集其合成所需的異源反應和酶動力學數據，并將其整合到酵母的酶約束代謝模型（ecYeastGEM v8.3.4，后文簡稱為 ecModel）中。隨后，通過通量平衡分析（FBA）模擬，評估了酵母在不同葡萄糖消耗率（1 mmol/gDW/h 和 10 mmol/gDw/h）下的最大生產潛力。與經典的基因組尺度代謝網絡模型（GEMs）相比，ecModel 具備的額外約束條件——酶量和酶動力學約束。結果表明，在 ecModel 中，由于酶約束的存在，產品合成和菌株生長之間不再是簡單的標準線性權衡（圖 1），最大產品合成速率受酶資源總量和關鍵酶動力學參數的限制。

圖 1 | A）用于計算預測的 103 種化學物質的化學分類。B）傳統代謝模型與酶約束代謝模型生產-生長相平面圖

具體而言，通過模擬，作者發現在低葡萄糖消耗速率條件下，40 種異源產品合成被識別受蛋白資源高度限制，此類產品主要集中在異源代謝物中，如萜烯和黃酮類化合物（來自甲羥戊酸途徑）（圖 2）。而來自天然生物合成途徑相關的（如氨基酸、有機酸和一些醇類）化合物合成受蛋白資源限制較小。相比于傳統 GEMs，ecModel 提供了從產物合成所需的底物成本和酶量成本兩方面考慮化學品合成所需投入的成本和資源。結果顯示，兩種生產成本之間存在正相關，且分子量較大的化學品更容易受到蛋白資源限制。基于此分析，可將 103 種化合物大致分為高度酶約束和輕度酶約束的兩種組別（圖 2），兩種酶約束模式也暗示了兩類化合物不同的產量提升策略。

圖 2 | A）103 種化合物生產受蛋白資源約束情況。B）各類別產物-底物成本和產物-所需酶量成本對應關系

在上述分析的基礎上，研究人員基于 ecModel 的優良預測性能，開發了指導細胞工廠系統級優化的計算工具包 ecFactory，以克服現有細胞工廠設計算法在篩選代謝工程靶點方面存在預測精度不高、組合靶點選擇困難等關鍵瓶頸。ecFactory 通過三個步驟進行代謝工程目標的預測（圖 3）。首先，利用已有強制目標函數的通量掃描算法（FSEOF）預測基因表達分數，確定目標基因改造策略，如基因表達強化、弱化與基因敲除。其次，根據酶的催化效率和連接性，對基因靶點進行分類，剔除編碼冗或低效的基因靶點。最后，確定從最優生物量形成模式轉變為生產模式所需的最小基因靶點改造組合。該計算工具的輸入模型采用標準的 SBML 格式，因此現有的來自其他物種的標準格式模型也可直接應用 ecFactory 進行計算。

圖 3 | ecFactory 計算流程

通過整合酶約束，ecFactory 顯著減少了需測試的基因靶點數量，提高了預測的準確性和實用性。在第一步中，FSEOF 平均預測了 85 個基因靶點（28 個過表達、42 個敲低和 15 個敲除），而經過 ecFactory 篩選后，最終每種產品平均剩余 7 個過表達、9 個敲低和 5 個敲除目標（圖 4）。匯總 103 種化合物的預測基因靶點發現，酵母中的 150 個內源基因被預測為至少一個化學品對應的的基因強化靶點；88 個不同的基因被預測為基因弱化靶點，129個被預測為基因敲除靶點。超過 50% 的基因強化、弱化和敲除靶點與 103 種產品中的一種或兩種相關（圖 4）。其中一小組基因被預測為大量產物高產所需的共同目標（也被稱為高頻繁目標），這些產物幾乎來自所有化學分類。

圖 4 | 提高酵母 103 種化學物質產量所需的基因改造靶點預測

進一步，研究人員對 ecFactory 算法的預測效果進行了系統評估。結果顯示，ecFactory 的預測結果與已報道的菌株改造策略顯示出高度一致性。如在已報道的 2-苯乙醇代謝工程改造案例中，ecFactory 預測的 12 個基因靶點中，有 7 個（過表達靶點：ARO2、PHA2、ARO10、ARO1、ARO4、ARO7 和 ZWF1）與實驗結果一致。對于亞精胺的高效合成，ecFactory 預測到 9 個（過表達靶點：SPE1、SPE2、SPE3、MEU1、ORT1、AGC1 和 GDH1；敲除/敲降靶點：CAR2 和 SPE4）與實驗結果一致基因改造策略（圖5）。此外，除了已被驗證的靶點，ecFactory 還可以識別出一些新的基因靶點。此外，通過總結 18 種化合物的改造案例，結果顯示 ecFactory 預測的靶點與已有的實驗報道靶點存在大量重合，進一步驗證了 ecFactory 預測的準確性。

圖 5|ecFactory 可用于預測代謝工程靶點，用于提高酵母合成亞精胺產量（實驗數據來源于 Nature Catalysis 2021, 4: 498–509）

最后，基于 ecFactory 的預測結果，作者為開發能夠生產多種化學品的平臺菌株提供了理論基礎。通過 t-distributed stochastic neighbor embedding（t-SNE）方法對 103 種化學品的基因靶點進行聚類分析，并將這些目標分為 8 個不同的簇。每個簇代表一組具有相似代謝工程策略的產品。例如，簇 1 和簇 2 主要包含高度受蛋白質約束的異源產品，這些產品需要通過減少呼吸作用的蛋白質負擔，將資源重新分配給異源酶的表達，從而提高目標化學品的產量。簇 3 主要包含受底物可用性限制的萜烯類化合物，這些產品需要增加 NADPH 的供應來提高產量。通過這種基于模型的設計方法，研究者提出了針對不同簇的代謝重編程策略，為開發具有廣泛應用的平臺菌株提供了新的思路，有望加速從石油經濟向生物經濟的轉型。

總的來說，這項研究表明 ecModels 作為微生物細胞工廠設計的基礎模型具備巨大潛力。該研究開發的 ecFactory 工具充分利用了酶約束模型的優勢，擁有靈活的靶點過濾策略，并對預測的基因靶點進行綜合打分排序。此外，ecFactory 可以預測提高目標生物產品合成的最小靶點組合。因此 ecFactory 的推廣使用有望顯著降低細胞工廠開發成本，縮短開發周期，在未來綠色發展戰略中發揮重要作用。

這項研究為生物制造領域提供了一種新的計算工具和策略，有望加速細胞工廠的理性改造和可持續升級。未來，隨著更多非模式生物的酶約束代謝模型的開發和完善，ecFactory 有望在更廣泛的生物體系中發揮作用，為可持續化學生產提供更多的解決方案。此外，研究團隊還指出，盡管 ecFactory 在預測基因改造靶點方面取得了顯著進展，但進一步的實驗驗證和模型優化仍然至關重要。例如，酶動力學參數的缺乏仍然是限制非模式生物模型開發的主要瓶頸。為此，研究團隊建議結合深度學習和貝葉斯推斷等先進技術，進一步完善酶約束代謝模型的構建和優化。

在上述論文中，上海交通大學生命科學技術學院魯洪中副教授與查爾姆斯理工大學 Jens Nielsen 教授為論文的共同通訊作者。該工作獲得中國國家重點研發計劃（2022YFA0913000）、上海市浦江人才計劃，以及國家自然科學基金（22208211 和 22378263）的資助。

魯洪中課題組長期從事于高精度數字細胞模型構建，破譯基因型-表型關系，解析生命運作規律；開發細胞工廠精準設計算法，實現 BT 和 IT 技術的深度結合，以期解決細胞代謝全局可預測、菌株理性改造等合成生物學領域的關鍵問題與挑戰。相關成果以一作或通訊作者發表于 Nat. Commun.、PNAS、Mol. Syst. Biol.、Brief. Bioinform.、Metab. Eng. 和 Trends. Biotechnol. 等國際知名期刊。

參考文獻

I. Domenzain, Y. Lu, H. Wang, J. Shi, H. Lu, & J. Nielsen, Computational biology predicts metabolic engineering targets for increased production of 103 valuable chemicals in yeast, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 122 （9） e2417322122, https://doi.org/10.1073/pnas.2417322122 （2025）.

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