植物源生物堿是一類重要的天然產(chǎn)物，具有多種藥理特性，其臨床應(yīng)用長(zhǎng)期受限于傳統(tǒng)獲取方式的效率瓶頸。以原小檗堿類化合物為例，代表性藥物羅通定（Rotundine）雖具有顯著鎮(zhèn)痛與抗焦慮活性，但其在藥用植物延胡索中的含量低。

此外，這些化合物的生物合成路徑復(fù)雜，且植物來(lái)源的 P450 酶在微生物中的表達(dá)存在困難，導(dǎo)致其合成效率低下。例如工程酵母中小檗堿的產(chǎn)量為 16.9 mg/L，羅通定的產(chǎn)量為 68.6 mg/L，仍然缺乏商業(yè)可行性。

針對(duì)這一挑戰(zhàn)，江南大學(xué)饒義劍團(tuán)隊(duì)在 Nature Communications 發(fā)表題為"A concise enzyme cascade enables the manufacture of natural and halogenated protoberberine alkaloids"的研究論文，報(bào)道了一種簡(jiǎn)潔的酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)，能夠從廉價(jià)易得的底物高效合成多種原小檗堿類生物堿。

在這項(xiàng)工作中，團(tuán)隊(duì)利用大腸桿菌全細(xì)胞催化實(shí)現(xiàn)了代表性藥物羅通定的高效合成，產(chǎn)量達(dá) 2.44 g/L；此外，也實(shí)現(xiàn)了鹵代原小檗堿生物堿的高效合成。這一突破標(biāo)志著合成生物學(xué)在復(fù)雜天然產(chǎn)物制造領(lǐng)域的里程碑進(jìn)展。

該研究設(shè)計(jì)了一種簡(jiǎn)化的 6 酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)，包含 4 個(gè)模塊：BIA 模塊、MT 模塊、BBE 模塊和 S9OMT 模塊。

研究團(tuán)隊(duì)首先對(duì)已報(bào)道的原小檗堿類生物堿的生物合成途徑進(jìn)行了全面分析，發(fā)現(xiàn)這些生物堿都基于中間體 (S)-網(wǎng)狀番荔枝堿（(S)-reticuline）進(jìn)行合成，其骨架為芐基異喹啉生物堿（BIAs）。

以羅通定為模型化合物，研究表明，其核心BIA骨架(S)-網(wǎng)狀番荔枝堿可以通過(guò)去甲烏藥堿合成酶（NCS）催化的多巴胺和2-(3,4-二羥基苯基)乙醛（2a）的偶聯(lián)反應(yīng)生成。

鑒于醛在微生物中不穩(wěn)定，研究人員使用羧酸還原酶（CAR）將容易獲得的 2-(3-羥基-4-甲氧基苯基)乙酸（1a）還原，從而在原位合成 2a（BIA模塊）。隨后的 O-甲基化和 N-甲基化可以通過(guò)去甲烏藥堿 6-O-甲基轉(zhuǎn)移酶（6OMT）和烏藥堿 N-甲基轉(zhuǎn)移酶（CNMT）實(shí)現(xiàn)，生成(S)-網(wǎng)狀番荔枝堿（MT模塊）。上述反應(yīng)分別被設(shè)計(jì)為 BIT 模塊和 MT 模塊，后者包含來(lái)自罌粟的 Ps6OMT 與來(lái)自黃連的 CNMT。

此外，還包括用于氧化環(huán)化的 BBE 模塊（來(lái)自 Eschscholzia californica的 BBE）和用于連續(xù)兩階段甲基化的 S9OMT 模塊（來(lái)自黃唐松草的 Tf S9OMT）。通過(guò)上述步驟簡(jiǎn)化了復(fù)雜的從頭生物合成途徑并減輕了產(chǎn)物或中間體在微生物中積累引起的細(xì)胞毒性。

為了能夠大規(guī)模生產(chǎn)羅通定，并避免復(fù)雜的蛋白質(zhì)純化和體外重建相關(guān)的輔因子的高成本，將設(shè)計(jì)的酶級(jí)聯(lián)整合到全細(xì)胞催化系統(tǒng)中。

通過(guò)分子伴侶、啟動(dòng)子工程、定向進(jìn)化和輔因子工程等手段，研究人員系統(tǒng)地優(yōu)化了小檗堿橋酶 BBE 的表達(dá)水平及其催化性能，有效解決了原小檗堿類生物堿生物合成中小檗堿橋酶催化活性差的固有難題。

圖 | 用于合成天然和鹵代原小檗堿生物堿的人工多酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)設(shè)計(jì)

隨后，基于結(jié)構(gòu)指導(dǎo)，作者對(duì) S9OMT 進(jìn)行了定向進(jìn)化，在保持其對(duì) 9-OH 高效甲基化的同時(shí)，顯著提高了其對(duì) 2-OH 的甲基化能力。

通過(guò)上述途徑構(gòu)建、酶改造及條件優(yōu)化，羅通定的產(chǎn)量達(dá)到了2.44 g/L，這是目前文獻(xiàn)報(bào)道中的最高產(chǎn)量。

為拓展該平臺(tái)的結(jié)構(gòu)多樣性潛力，研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步開(kāi)發(fā)鹵代原小檗堿的生物合成路線。通過(guò)將 CNMT 替換為工程改造的 CNMT#（F92A/N332A 突變體），結(jié)果顯示，通過(guò)即插即用策略用該變體取代 CNMT 的催化級(jí)聯(lián)能夠從多種鹵代 2-(3-羥基苯基)乙酸中高效合成各種鹵代原小檗堿生物堿，其特點(diǎn)是在 4-、5-和 6-位上有氯或氟取代。

這項(xiàng)研究通過(guò)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)潔的酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)，成功解決了原小檗堿類生物堿合成路徑復(fù)雜和效率低下的問(wèn)題。該方法不僅縮短了合成步驟，還避免了 P450 酶的修飾需求，為未來(lái)大規(guī)模生產(chǎn)秋水仙堿及其他復(fù)雜苯乙基異喹啉生物堿提供了新的平臺(tái)。

1.Li, F., Yuan, Z., Gao, Y. et al. A concise enzyme cascade enables the manufacture of natural and halogenated protoberberine alkaloids. Nat Commun 16, 1904 (2025). https://doi.org/10.1038/s41467-025-57280-0

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