研究背景

膠質(zhì)母細(xì)胞瘤是成人最具侵襲性的原發(fā)性腦癌，三分之二的患者對(duì)當(dāng)前標(biāo)準(zhǔn)治療系統(tǒng)療法具有先天耐藥性。盡管免疫檢查點(diǎn)抑制劑在黑色素瘤腦轉(zhuǎn)移等病理中表現(xiàn)出顯著的顱內(nèi)活性，但膠質(zhì)母細(xì)胞瘤對(duì)單藥免疫檢查點(diǎn)阻斷具有耐藥性。為了更好地理解膠質(zhì)母細(xì)胞瘤對(duì)免疫檢查點(diǎn)抑制劑的分子反應(yīng)，并識(shí)別可靶向的免疫逃逸途徑，該研究團(tuán)隊(duì)之前曾報(bào)道了一項(xiàng)關(guān)于新輔助和單獨(dú)輔助帕博利珠單抗（pembrolizumab）的隨機(jī)手術(shù)窗口試驗(yàn)，研究對(duì)象為接受手術(shù)切除的復(fù)發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者。通過(guò)對(duì)比新輔助與未經(jīng)新輔助治療的腫瘤基因表達(dá)譜，該研究發(fā)現(xiàn)了一個(gè)分子反應(yīng)特征，包括細(xì)胞周期/癌癥增殖基因的下調(diào)和T細(xì)胞/干擾素γ相關(guān)基因的上調(diào)。細(xì)胞周期基因特征與總生存期呈負(fù)相關(guān)。重要的是，與單獨(dú)輔助使用帕博利珠單抗相比，新輔助治療的加入與總生存期的顯著延長(zhǎng)有關(guān)。在此，該研究團(tuán)隊(duì)報(bào)告了一項(xiàng)單臂、非隨機(jī)新輔助帕博利珠單抗擴(kuò)展隊(duì)列研究的結(jié)果（NCT02852655），以增強(qiáng)對(duì)帕博利珠單抗腫瘤分子反應(yīng)及其對(duì)總生存期影響的藥效學(xué)終點(diǎn)的觀察。

研究結(jié)果

為了確認(rèn)帕博利珠單抗在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中的藥效學(xué)效應(yīng)，該研究設(shè)計(jì)了一個(gè)擴(kuò)展隊(duì)列，以補(bǔ)充完善之前報(bào)道的多中心、隨機(jī)、開(kāi)放標(biāo)簽的手術(shù)研究的藥效學(xué)終點(diǎn)，該研究比較了新輔助聯(lián)合輔助帕博利珠單抗（新輔助組）與單獨(dú)輔助帕博利珠單抗（輔助組）在復(fù)發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者中的療效。所有患者均被分配到新輔助組，并在手術(shù)切除腫瘤前約14天接受單劑量帕博利珠單抗治療，手術(shù)恢復(fù)后每3周接受一次帕博利珠單抗治療，直至疾病進(jìn)展或出現(xiàn)不可接受的毒性。2020年6月至2021年8月期間，共有25名患者在四個(gè)機(jī)構(gòu)入組，構(gòu)成了意向治療人群。

在初步研究中，帕博利珠單抗治療導(dǎo)致細(xì)胞周期/癌癥增殖基因特征的減少和T細(xì)胞/干擾素γ特征的增加。細(xì)胞周期/癌癥增殖基因特征與生存期呈負(fù)相關(guān)。當(dāng)前擴(kuò)展隊(duì)列的主要目標(biāo)是增強(qiáng)這一觀察結(jié)果，并觀察帕博利珠單抗是否會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞周期/癌癥增殖相關(guān)基因表達(dá)減少的這一假設(shè)。該研究對(duì)擴(kuò)展的新輔助隊(duì)列的切除腫瘤組織進(jìn)行了批量RNA測(cè)序（RNAseq），并與臨床試驗(yàn)第一階段的基因表達(dá)數(shù)據(jù)合并，作為該擴(kuò)展研究的預(yù)設(shè)主要終點(diǎn)（圖1a）。

臨床試驗(yàn)達(dá)到了其主要藥效學(xué)終點(diǎn)，綜合基因表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，在新輔助隊(duì)列中，帕博利珠單抗治療的腫瘤組織中細(xì)胞周期/癌癥增殖相關(guān)絕對(duì)富集評(píng)分的中位數(shù)顯著降低至-0.2996（四分位間距-0.5853至0.2040），而未治療的腫瘤組織中為0.5172（四分位間距0.0712-0.6579），p=0.009（圖1b）。有趣的是，擴(kuò)展隊(duì)列中細(xì)胞周期基因集下調(diào)的程度并不像初始隊(duì)列中那么顯著。合并隊(duì)列還顯示，與未治療的腫瘤組織相比，帕博利珠單抗治療的腫瘤組織中T細(xì)胞/IFN基因特征的富集呈現(xiàn)異質(zhì)性（圖1c，p=0.08）。對(duì)兩個(gè)新輔助隊(duì)列分別進(jìn)行分析，與輔助組相比，細(xì)胞周期和干擾素γ相關(guān)基因表達(dá)變化的模式相同，但擴(kuò)展新輔助隊(duì)列并未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。

與初始研究一樣，相對(duì)于僅接受輔助治療隊(duì)列，新輔助帕博利珠單抗治療并未誘導(dǎo)腫瘤浸潤(rùn)性淋巴細(xì)胞（tumor-infiltrating lymphocyte，TIL）的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著增加。這些發(fā)現(xiàn)證實(shí)了PD1導(dǎo)向免疫檢查點(diǎn)抑制劑對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤基因表達(dá)模式的藥效學(xué)效應(yīng)，但提示可能存在某些機(jī)制，通過(guò)防止T細(xì)胞浸潤(rùn)或抑制腫瘤微環(huán)境中TIL功能，從而介導(dǎo)先天耐藥性，正如該研究團(tuán)隊(duì)近期研究所示。

為了開(kāi)發(fā)一個(gè)能夠預(yù)測(cè)這些患者臨床過(guò)程的生物標(biāo)志物，該研究團(tuán)隊(duì)使用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型識(shí)別在新輔助隊(duì)列中差異表達(dá)的基因特征，并且這些特征也與生存期獨(dú)立相關(guān)。細(xì)胞周期基因特征（Farmers_Breast_Cancer_Cluster_2）被新輔助帕博利珠單抗治療下調(diào)，并被發(fā)現(xiàn)是總生存期的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素（圖1d），風(fēng)險(xiǎn)比（HR）為3.54，置信區(qū)間（CI）為[1.17–10.65]，p=0.025。將細(xì)胞周期基因特征（Farmers_Breast_Cancer_Cluster_2）加入Cox模型顯著提高了總生存期的可解釋方差（即R平方），從32%提高到45%，這與該研究團(tuán)隊(duì)在初始報(bào)告中的發(fā)現(xiàn)一致。有趣的是，干擾素γ相關(guān)基因集（Ayers_et_al_IFN_genes）與生存期并未獨(dú)立相關(guān)，風(fēng)險(xiǎn)比為0.93，置信區(qū)間為[0.32-2.70]，p=0.893，這表明I型和II型干擾素可能難以區(qū)分，可能代表介導(dǎo)對(duì)免疫檢查點(diǎn)抑制劑先天耐藥性的慢性炎癥。在該隊(duì)列中，注冊(cè)時(shí)的總類固醇劑量是唯一與生存期顯著相關(guān)的臨床因素，與細(xì)胞周期基因共同成為此隊(duì)列的顯著預(yù)后因素（圖1d，風(fēng)險(xiǎn)比1.44，置信區(qū)間[1.06–1.95]，p=0.021）。通過(guò)CybersortX對(duì)批量基因表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行解卷分析顯示，細(xì)胞周期基因特征的變化顯著且直接與腫瘤分?jǐn)?shù)相關(guān)，而T細(xì)胞/IFN基因表達(dá)變化與髓系分?jǐn)?shù)相關(guān)(圖1e，f)。這些發(fā)現(xiàn)表明，抗PD1免疫檢查點(diǎn)阻斷在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中觸發(fā)的細(xì)胞周期基因抑制是由腫瘤細(xì)胞驅(qū)動(dòng)的，并且與這些患者的生存期獨(dú)立相關(guān)。

圖1：帕博利珠單抗治療與T細(xì)胞/干擾素-γ基因相關(guān)特征增加以及細(xì)胞周期/癌癥增殖基因特征減少有關(guān)

在意向治療分析中，新輔助擴(kuò)展隊(duì)列的中位總生存期為204天（6.8個(gè)月），而初始新輔助隊(duì)列為417天（13.7個(gè)月），初始僅輔助隊(duì)列為228天（7.5個(gè)月）。新輔助擴(kuò)展隊(duì)列的中位無(wú)進(jìn)展生存期為75天（2.5個(gè)月），而初始新輔助隊(duì)列為99.5天（3.3個(gè)月），初始僅輔助治療隊(duì)列為72.5天（2.5個(gè)月）。該研究的次要終點(diǎn)PFS-6在新輔助擴(kuò)展隊(duì)列為0%，而之前報(bào)道的初始新輔助隊(duì)列為33.3%（95%置信區(qū)間：16.3%-68.2%）。合并新輔助隊(duì)列的PFS-6為19.5%（95%置信區(qū)間：9.29%-41.2%），而僅輔助隊(duì)列為13.3%（95%置信區(qū)間：3.67%-48.4%）。三個(gè)隊(duì)列之間在總生存或無(wú)進(jìn)展生存方面沒(méi)有差異（p>0.05和p=0.0543，分別為Mantel-Cox檢驗(yàn)）。在經(jīng)過(guò)手術(shù)且組織學(xué)證實(shí)為復(fù)發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的患者中（mITT），新輔助擴(kuò)展隊(duì)列的中位總生存期為209.5天（7.0個(gè)月），而初始新輔助隊(duì)列為400天（13.2個(gè)月），初始僅輔助治療隊(duì)列為192天（6.3個(gè)月）。

圖2：臨床試驗(yàn)設(shè)計(jì)和生存結(jié)果

與該研究團(tuán)隊(duì)的隨機(jī)試驗(yàn)中的初始新輔助隊(duì)列相比，擴(kuò)展新輔助隊(duì)列的總生存期較為有限，但藥效學(xué)終點(diǎn)表明，新輔助帕博利珠單抗劑量并未像初始隊(duì)列中那樣顯著下調(diào)腫瘤細(xì)胞周期基因。為了進(jìn)一步評(píng)估這些基因表達(dá)變化相關(guān)的生物學(xué)和臨床結(jié)果，該研究團(tuán)隊(duì)根據(jù)患者的中位細(xì)胞周期/癌癥增殖和T細(xì)胞/干擾素γ相關(guān)基因特征將患者分為四組。事后分析顯示，這四組之間的總生存期存在顯著差異（圖3c，logrank檢驗(yàn)，p值<0.0001）。此外，四組中新輔助與輔助患者的分布差異顯著（圖3b，卡方檢驗(yàn)，p=0.027）。有趣的是，所有具有干擾素高和細(xì)胞周期低基因特征的亞組（第3組）的患者均接受了新輔助帕博利珠單抗治療（13/13患者），并且與其它亞組相比具有顯著更長(zhǎng)的生存期，為420天（13.8個(gè)月）（圖3b，c）。與“細(xì)胞周期高”患者相比，“細(xì)胞周期低”組的總生存期有所改善，而“細(xì)胞周期高”患者顯示出最短的生存時(shí)間（第2組和第4組）。將細(xì)胞周期和干擾素特征均被分類為高的患者（第4組）的生存期最短，死亡風(fēng)險(xiǎn)比為7.46（置信區(qū)間1.22–45.46，p值=0.029）。與低干擾素/T細(xì)胞特征的腫瘤相比，高干擾素/T細(xì)胞特征的腫瘤具有顯著更高的TIL密度（圖3e，f）。

為了探究導(dǎo)致這干擾素高組（第3組和第4組）之間生存期巨大差異的生物學(xué)過(guò)程，該研究團(tuán)隊(duì)篩選了各種炎癥/免疫激活相關(guān)基因特征。發(fā)現(xiàn)第4組在STAT3和TNF-α相關(guān)基因特征的富集上顯著高于第3組。STAT3和TNF-α的異常激活與腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲以及免疫抑制細(xì)胞群體（如MDSC和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞）的招募有關(guān)。值得注意的是，STAT3已被鑒定為間質(zhì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤亞型的主要調(diào)節(jié)因子。這些發(fā)現(xiàn)表明，新輔助抗PD1免疫檢查點(diǎn)阻斷可以觸發(fā)腫瘤基因表達(dá)狀態(tài)的變化，使其呈現(xiàn)低細(xì)胞周期/癌癥增殖和高T細(xì)胞/干擾素γ相關(guān)特征，并且這種表達(dá)特征與T細(xì)胞浸潤(rùn)和在帕博利珠單抗治療隊(duì)列中最長(zhǎng)的生存期相關(guān)。
一名患者因切除腫瘤組織的分析未能證實(shí)復(fù)發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤而被排除在意向治療人群（mITT）之外。三名患者因缺乏隨訪影像學(xué)記錄而被iRANO標(biāo)準(zhǔn)排除在PFS分析之外。基線特征在初始和擴(kuò)展術(shù)前隊(duì)列之間相似。帕博利珠單抗耐受性良好，該隊(duì)列未發(fā)現(xiàn)任何新的、意料之外的毒性反應(yīng)。共有六例3級(jí)及以上不良事件，包括腦水腫（2例）、頭痛、疲勞、腎上腺功能不全和甲狀腺功能亢進(jìn)。

圖3：細(xì)胞周期/癌癥增殖以及T細(xì)胞和干擾素特征決定了接受新輔助帕博利珠治療的患者的生存組

該研究團(tuán)隊(duì)的擴(kuò)展隊(duì)列中，復(fù)發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者接受新輔助聯(lián)合輔助帕博利珠單抗治療，達(dá)到了其主要藥效學(xué)終點(diǎn)。合并的基因表達(dá)分析表明，帕博利珠單抗的活性在復(fù)發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中具有明確的基因特征，與細(xì)胞周期和癌癥增殖基因的減少以及T細(xì)胞/干擾素相關(guān)基因的增加有關(guān)。先前的研究已經(jīng)表明，腫瘤中干擾素γ的高基線或治療中表達(dá)與免疫檢查點(diǎn)抑制劑的反應(yīng)相關(guān)。與該研究團(tuán)隊(duì)關(guān)于新輔助帕博利珠單抗的生存優(yōu)勢(shì)的初步報(bào)告一致，該研究識(shí)別出一個(gè)特定的亞組，即13名新輔助隊(duì)列中的患者，其特征是高腫瘤干擾素γ特征和低細(xì)胞周期特征，該組患者具有非常長(zhǎng)的生存期，中位數(shù)為13.8個(gè)月。同樣，對(duì)接受免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療的黑色素瘤患者的基線和治療中腫瘤樣本的分析顯示，高干擾素γ特征伴隨G2M檢查點(diǎn)基因的減少與完全和部分臨床反應(yīng)顯著相關(guān)，表明這些是免疫檢查點(diǎn)阻斷獲益的廣泛生物標(biāo)志物。由于干擾素γ在多種癌癥中誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯，免疫細(xì)胞衍生的干擾素γ可能是該研究中最長(zhǎng)生存期隊(duì)列中低細(xì)胞周期評(píng)分的直接原因。

癌癥被廣泛認(rèn)為會(huì)產(chǎn)生慢性炎癥狀態(tài)。這些數(shù)據(jù)表明，腫瘤微環(huán)境中的局部炎癥反應(yīng)可能是情境性的，因?yàn)榈缺壤幕颊撸ㄎ粗委熍c接受新輔助治療的患者）顯示出高細(xì)胞周期和高T細(xì)胞/IFN轉(zhuǎn)錄特征。具有這種轉(zhuǎn)錄模式的患者腫瘤中，STAT-3和TNF信號(hào)顯著富集。因此，這些腫瘤可能類似于膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的間質(zhì)亞型，并且表明這種慢性炎癥腫瘤微環(huán)境可能對(duì)免疫檢查點(diǎn)抑制劑具有固有耐藥性。在其他顱外腫瘤中，通過(guò)減少這種慢性炎癥狀態(tài)的策略已經(jīng)取得了成功，并隨后恢復(fù)了對(duì)免疫檢查點(diǎn)阻斷的反應(yīng)。

膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中的p16-CDK4/6-Rb信號(hào)通路作為主要的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子，其過(guò)度激活可能也獨(dú)立地為免疫逃逸提供機(jī)制。在腫瘤和T細(xì)胞中均涉及CDK4/6信號(hào)通路，其通過(guò)抑制腫瘤內(nèi)源性抗原處理和呈遞，以及調(diào)節(jié)T細(xì)胞亞群，從而介導(dǎo)免疫逃逸。在黑色素瘤中，CDK4/6抑制劑和免疫檢查點(diǎn)抑制劑的聯(lián)合應(yīng)用被廣泛關(guān)注，特別是在CDK4/6過(guò)度激活頻繁的腫瘤中，如膠質(zhì)母細(xì)胞瘤。然而，CDK4/6抑制劑abemaciclib與帕博利珠單抗聯(lián)合在轉(zhuǎn)移性乳腺癌的1b期臨床試驗(yàn)中顯示出高比例的轉(zhuǎn)氨酶升高和肺炎。目前，關(guān)于聯(lián)合靶向CDK4/6信號(hào)和免疫檢查點(diǎn)是否會(huì)產(chǎn)生顯著的抗腫瘤活性仍然未得到解答。

與單獨(dú)輔助相比，新輔助治療在復(fù)發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的臨床影響尚不清楚。該研究未能證實(shí)新輔助帕博利珠單抗的生存優(yōu)勢(shì)。與該研究團(tuán)隊(duì)的初步隨機(jī)研究相比，該研究的新輔助擴(kuò)展隊(duì)列的生存期顯著降低。盡管與初始新輔助隊(duì)列相比，擴(kuò)展隊(duì)列中由于術(shù)后腫瘤體積增加以及高比例IDH野生型腫瘤可能影響了生存期，但這些差異尚未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。

該研究存在一些重要的局限性。它未對(duì)生存分析進(jìn)行充分的樣本量估算，因此新輔助帕博利珠單抗對(duì)復(fù)發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者的生存影響仍不清楚。其他局限性包括其單臂設(shè)計(jì)、缺乏同期對(duì)照隊(duì)列以及樣本量小。未來(lái)的臨床試驗(yàn)應(yīng)針對(duì)生存分析進(jìn)行充分的樣本量估算，并評(píng)估這些生物標(biāo)志物特征是否能夠預(yù)測(cè)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤對(duì)免疫檢查點(diǎn)抑制的反應(yīng)。

參考文獻(xiàn)：McFaline-Figueroa, J.R., Sun, L., Youssef, G.C.et al.Neoadjuvant anti-PD1 immunotherapy for surgically accessible recurrent glioblastoma: clinical and molecular outcomes ofa stage2 single-arm expansion cohort.Nat Commun15, 10757 (2024). https://doi.org/10.1038/s41467-024-54326-7