研究概述

本研究報(bào)告了一例74歲男性患者的罕見(jiàn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤，主要生長(zhǎng)在軟腦膜。患者表現(xiàn)出頭痛、手抖和認(rèn)知障礙，MRI顯示腦干和小腦軟腦膜增強(qiáng)，但未見(jiàn)明顯的瘤塊。細(xì)胞游離DNA（circulating free DNA, cfDNA）是指在血液或其他體液中游離存在的DNA片段。這些DNA片段通常源自多種細(xì)胞，包括腫瘤細(xì)胞、凋亡或壞死的正常細(xì)胞。cfDNA的分析在醫(yī)學(xué)研究和臨床診斷中具有重要意義。cfDNA可以用于檢測(cè)腫瘤特異性突變，幫助診斷癌癥、監(jiān)測(cè)腫瘤進(jìn)展和評(píng)估治療反應(yīng)。盡管傳統(tǒng)細(xì)胞學(xué)分析未能檢測(cè)到腫瘤細(xì)胞，通過(guò)腦脊液中的細(xì)胞游離DNA納米孔測(cè)序，研究人員成功識(shí)別出TERT啟動(dòng)子突變和特征性的拷貝數(shù)變異。此方法顯示了腦脊液DNA的潛力，作為一種快速且微創(chuàng)的診斷工具，為高級(jí)別膠質(zhì)瘤的確認(rèn)提供了有力證據(jù)。這一發(fā)現(xiàn)為臨床醫(yī)生在處理類似病例時(shí)提供了新的見(jiàn)解，也提供了明確的診斷依據(jù)，有助于制定后續(xù)的治療方案。

病例報(bào)告

患者為74歲的男性，癥狀為頭痛、手抖、步態(tài)不穩(wěn)及認(rèn)知障礙，并在前過(guò)去兩個(gè)月內(nèi)逐漸加重。患者既往有前列腺癌病史，5年前接受了放射治療，2個(gè)月前在回腸末端發(fā)現(xiàn)神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤（neuroendocrine tumor，NET）1級(jí)。腦MRI顯示：未見(jiàn)腦實(shí)質(zhì)內(nèi)病變，腦干、小腦及顱神經(jīng)周圍軟腦膜可見(jiàn)強(qiáng)化（圖1a）。當(dāng)時(shí)的鑒別診斷包括“神經(jīng)炎癥性疾病”和轉(zhuǎn)移性疾病（不除外前列腺癌的軟腦膜轉(zhuǎn)移和1級(jí)NET）。除回腸NET外，PET-CT掃描未發(fā)現(xiàn)顱外原發(fā)腫瘤或轉(zhuǎn)移性病灶。腰椎穿刺獲取的腦脊液顯示白細(xì)胞數(shù)量輕度增加(14個(gè)細(xì)胞/μl），葡萄糖水平正常（2.9 mmol/l），總蛋白水平增加（8.75 g/l），與軟腦膜轉(zhuǎn)移性疾病一致。在第三次腰椎穿刺時(shí)，腦脊液的細(xì)胞學(xué)和循環(huán)腫瘤細(xì)胞分析仍然為陰性。然而，對(duì)cfDNA的下一代測(cè)序顯示，端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（telomerase reverse transcriptase,TERT）啟動(dòng)子突變，加強(qiáng)了患者實(shí)際上患有軟腦膜惡性腫瘤的假設(shè)。

圖1：臨床診斷學(xué)圖。a MRI增強(qiáng)像顯示小腦和腦橋周圍的強(qiáng)化灶（I、II中的箭頭）。兩側(cè)顱神經(jīng)VII、VIII的強(qiáng)化（III中的箭頭）。b腦脊液DNA測(cè)序所得序列reads的大小分布。c 通過(guò)納米孔測(cè)序獲得的CNV圖譜。d腫瘤分類為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤-MID

研究者選擇對(duì)腦脊液進(jìn)行納米孔測(cè)序。從2 ml的腦脊液中提取了約200 ng的DNA。使用調(diào)整后的文庫(kù)準(zhǔn)備方案，對(duì)100 ng的樣本進(jìn)行測(cè)序，得到1800萬(wàn)reads。映射的讀長(zhǎng)顯示了cfDNA典型的大約 150個(gè)堿基對(duì)周期性（圖1b），大部分片段在143-175個(gè)堿基對(duì)范圍內(nèi)。拷貝數(shù)變異（copy-number variation，CNV）特征（圖1c）顯示了出某些變化，包括PDGFRA和MDM4增益和CDKN2A/B損失，高偏差表明腫瘤分?jǐn)?shù)高。在完整或下采樣數(shù)據(jù)集上進(jìn)行DNA甲基化分析，得到了膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、亞型中線（GBM-MID）的高可信度評(píng)分（圖1d）。進(jìn)行DNA甲基化分析確定了GBM-MID的分類以及CNV譜的改變。

考慮到顱內(nèi)疾病和臨床惡化，患者得到了最好的支持治療。但是，患者的病情迅速惡化，很快就去世了。病理顯示了分散性增厚和不透明軟腦膜，尤其是在額葉（圖2a)、小腦和腦干周圍。肉眼觀察未發(fā)現(xiàn)腦實(shí)質(zhì)內(nèi)有腫瘤腫塊。在顯微鏡下，腫瘤細(xì)胞在整個(gè)軟腦膜中廣泛出現(xiàn)浸潤(rùn)（圖2b）。顯微鏡下顯示腫瘤在腦實(shí)質(zhì)內(nèi)略微生長(zhǎng)，在腦室的室管膜下方（圖2c、d）和中腦的皮質(zhì)下方存在彌漫性浸潤(rùn)性生長(zhǎng)。腫瘤細(xì)胞呈星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞核高度不典型，染色質(zhì)粗糙（圖2d）。免疫組化證實(shí)了腫瘤的膠質(zhì)性質(zhì)（Olig2；圖2e）。偶爾觀察到有絲分裂象，但缺乏壞死和明顯的微血管增生。值得注意的是，腫瘤細(xì)胞增殖活性通過(guò)Ki-67染色顯示為中至高度（約20-30%；圖2f）。這些病理結(jié)果結(jié)合TERT啟動(dòng)子突變的鑒定，使得可以進(jìn)行膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（IDH野生型）的組分子診斷，這與患者生前腦脊液納米孔測(cè)序所建議的診斷完全一致。

圖2：病理。腦切片顯示軟腦膜渾濁增厚（a，白色箭頭）。顯微鏡下，非典型細(xì)胞彌漫分布在軟膜腔內(nèi)（b）。在某些區(qū)域，這些細(xì)胞也略微存在于室管膜下/腦室周圍，例如靠近海馬（c，d，方框），在相鄰的深層腦溝中，這些細(xì)胞的積累更為密集（*）。Olig-2（e）和Ki-67（f）的免疫組化染色分別確認(rèn)了腫瘤的膠質(zhì)性質(zhì)和增殖活性。L：軟膜；CTX：大腦皮層的分子層；HE：蘇木精-伊紅染色。

1.研究者報(bào)告了一例IDH野生型膠質(zhì)母細(xì)胞瘤，其主要生長(zhǎng)在軟腦膜。這類病例既往很少有報(bào)道，診斷非常具有挑戰(zhàn)性。利用腦脊液cfDNA的納米孔測(cè)序，進(jìn)行DNA甲基化分類是一種快速和微創(chuàng)的方法，以獲得直接的診斷建議。

2.研究者假設(shè)從腦脊液中回收的大量腫瘤DNA是由于腫瘤細(xì)胞與腦脊液之間的大面積地接觸。在小且局限性的腫瘤中，cfDNA的獲取和測(cè)序可能更具挑戰(zhàn)性。TERT啟動(dòng)子突變的發(fā)現(xiàn)、CNV特征的變化以及高置信度的分類為高級(jí)別膠質(zhì)瘤/膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的診斷提供了充分的證據(jù)。

3.準(zhǔn)確的診斷對(duì)患者及其家屬非常有幫助，因?yàn)檫@為繼續(xù)進(jìn)行姑息治療奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：Sol Nik,Kooi Evert-Jan,Pagès-Gallego Marc et al. Glioblastoma, IDH-wildtype with primarily leptomeningeal localization diagnosed by nanopore sequencing of cell-free DNA from cerebrospinal fluid.[J] .Acta Neuropathol, 2024, 148: 35.