近日，東南大學附屬中大醫院神經內科謝春明教授及徐州醫科大學高豐雷教授團隊在Advanced Materials在線發表題為Engineering EVs-Mediated mRNA Delivery Regulates Microglia Function and Alleviates Depressive-Like Behaviors”的文章。該課題從mRNA基因療法出發，結合納米技術，開發了一種基于工程化細胞外囊泡的治療性MANF mRNA和納米酶的雙遞送系統，通過多種途徑調控小膠質細胞功能降低神經炎癥水平，繼而改善抑郁病理，達到抗抑郁治療的目的，這項研究展示了一種新的抗抑郁療法，并建立了mRNA技術用于治療中樞神經系統疾病的新范式。

抑郁癥(MDD)是一種慢性精神疾病，嚴重損害患者的心理社會功能，降低生活質量。藥物治療是最主要的治療手段，但目前的臨床抗抑郁治療藥物存在作用機制單一，起效緩慢，部分病人不敏感的問題，尋找新的治療靶點，開發新的抗抑郁治療藥物是當前臨床抗抑郁治療的重要補充。

盡管MDD的生物學機制尚完全不清楚，現已揭示小膠質細胞介導的神經炎癥在抑郁樣行為的發展中起著關鍵作用，幾項臨床研究揭示了內質網應激（ERS）和線粒體功能障礙在精神疾病(尤其是MDD)的發生發展中存在緊密聯系。內質網和線粒體之間接觸的微區稱為線粒體相關膜，是促進內質網和線粒體之間鈣轉運的平臺。ERS誘導Ca2+釋放到細胞質中，導致線粒體內膜去極化，并誘導線粒體活性氧(ROS)的形成，這反過來又加重了ERS。這種相互促進的關系可能導致小膠質細胞的持續激活和炎癥介質的長期釋放，最終誘導抑郁樣行為。重要的是，mRNA療法的最新發展為一些重大疾病的治療提供了可能。針對以上發現，研究人員設計了基于細胞外泡囊的雙遞送系統（CM-sEVs），旨在穿過血腦屏障，促進中腦星形膠質細胞源性神經營養因子(MANF) mRNA和Cu NDs納米酶同時進入大腦。這種雙管齊下的方法，同時針對內質網應激和線粒體損傷及其之間的功能串擾，抑制小膠質細胞過度激活，促進小膠質細胞的M2極化，并抑制NF-??B信號通路。

圖1：CM-sEVs的構建過程和作用機制

（1） sEVs介導的功能性mRNA體外遞送

研究人員在體外水平研究了BV2細胞對CM-sEVs的攝取，使用DIR標記CM-sEVs后，觀察到BV2細胞內CM-sEVs熒光信號隨孵育時間的延長逐漸增多，并在12小時后，與內體分離，釋放到細胞質進行翻譯。在體外血腦屏障模型中，CM-sEVs表現出良好的血腦屏障透過性和炎癥趨向性。通過免疫熒光試驗和WB試驗評估了MANF蛋白的有效翻譯。

圖2：體外水平研究 sEVs介導的功能性mRNA遞送

（2）CM-sev減輕ERS，改善線粒體損傷并抑制BV2中線粒體-ER接觸的增加

隨后，研究人員評估了CM-sEVs通過靶向ER-線粒體串擾調節小膠質細胞功能的作用。使用內毒素LPS誘導BV2細胞建立體外炎癥模型，CM-sEVs處理減少了ERS標記物CHOP和GRP78表達水平的增加。生物樣本TEM圖像顯示， CM-sEVs處理阻止了LPS誘導的細胞器間距離的增加，并恢復了正常的線粒體結構。采用mag-fluo4和Rhod2探針分別監測內質網和線粒體中的Ca2+濃度。結果表明，CM-sEVs在一定程度上改善了Ca2+向線粒體的轉移。使用mito-tracker Red標記線粒體，在共聚焦顯微鏡下觀察它們在細胞內的形態。與對照組相比，LPS組線粒體形態模糊，碎裂，在核周聚集，而CM- sEVs將線粒體形態恢復正常。

圖3：CM-sEVs通過內質網-線粒體相互作用調節小膠質細胞功能

（3）改變細胞內ROS水平可以調節小膠質細胞極化表型。在MDD的病理學中，活化的小膠質細胞產生大量的活性氧。研究者評估了CM-sEVs清除ROS的能力，在LPS誘導的炎癥模型中，CM-sEVs的處理明顯降低了ROS檢測探針DCFH-DA的熒光信號，免疫熒光染色顯示，在LPS的刺激下M1標記CD86的熒光信號顯著增強，而CM-sEVs促進M2小膠質細胞的極化，表現為M2標記CD206表達增加，CD86表達減少。LPS暴露誘導BV2細胞中促炎細胞因子(IL-6、IL-1??和TNF-??)的mRNA表達上，CM-sEVs降低了促炎細胞因子的表達，增加了抗炎因子IL-10的表達，進一步表明小膠質細胞更傾向于向M2表型極化。

圖4： CM-sEVs對LPS誘導的小膠質細胞活化的影響

這些發現表明ERS、線粒體損傷和氧化還原失衡可能是相互聯系的，共同促成了小膠質細胞的持續活化和炎癥介質的延長釋放。CM-sEVs通過各種機制調節小膠質細胞，包括同時抑制ER-線粒體串擾、維持線粒體穩態和誘導小膠質細胞M2極化，從而改善神經毒素誘導的免疫反應和神經炎癥。

（4）CM-sEVs改善LPS誘導的小鼠焦慮和抑郁樣行為

為了評估CM-sEVs在活體動物水平減輕抑郁行為的作用，研究人員通過LPS的反復注射誘導慢性炎性抑郁模型，通過開放曠場試驗來評估焦慮樣行為。結果顯示CM-sEVs增加了抑郁小鼠的總運動距離，增加了中央區域的停留時間和活動時間。LPS處理的小鼠在蔗糖偏好測中表現出明顯較低的蔗糖偏好分數，并且在強迫游泳試驗和懸尾實驗中表現出較長的不動持續時，CM-sEVs改善了由LPS治療引起的這些行為數據的異常。

此外，研究者還利用小動物7.0T MRI成像系統，進行了腦組織結構分析，結果表明，在CM-sEVs治療前后，在杏仁皮質區后部，內側區（COApm），皮質杏仁核區后部，外側區（COApl），中央杏仁核，內側部（CEAm）和中腦導水管周圍灰質(PAG)區的體積發生了變化，這些發現為CM-sEVs改善抑郁行為的神經機制提供了初步的見解。

圖5：CM-sEVs改善LPS誘導的抑郁樣行為及相關神經機制

綜上所述，研究者設計了一個基于sEVs的遞送系統，成功地將MANF mRNA轉運到大腦，并證實了mRNA在小鼠腦中的有效翻譯。研究發現，內質網和線粒體之間的雙向反饋參與了小膠質細胞的激活。這種mRNA和納米酶協同遞送的方法通過多種途徑減輕小膠質細胞誘導的神經炎癥反應，同時表現出良好的生物安全性和生物相容性，為治療抑郁癥或其他針對ER-線粒體相互作用的CNS炎癥性疾病提供了新的參考，并強調了MANF通過調節ER應激來調節神經炎癥反應的作用。這項研究為抗抑郁藥物的開發提供了新的見解，證明了mRNA療法在中樞神經系統中的應用。

東南大學醫學院博士研究生葛可楨為本文的唯一第一作者，東南大學附屬中大醫院神經內科謝春明教授和徐州醫科大學藥學院高豐雷教授為本文共同通訊作者。該研究獲得科技創新2030-“腦科學與類腦研究”、國家重點研發計劃、國家自然科學基金面上項目、江蘇省杰出青年基金等項目資助。感謝徐州醫科大學公共實驗研究中心董富興博士對激光掃描共聚焦顯微鏡的使用給予熱情幫助。（編輯王倩 校對劉敏 編審程守勤）

原文鏈接：https://doi.org/10.1002/adma.202418872