探索高原大棚越冬結(jié)球甘藍(lán)游離小孢子培養(yǎng)新方法

基金項(xiàng)目：國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)（CARS-23-G07）；河北省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)（HBCT2024140201，HBCT2024140203）

康少輝等

結(jié)球甘藍(lán)為一年生至二年生的十字花科蕓薹屬植物，具有顯著的雜交優(yōu)勢。傳統(tǒng)育種方式主要是自交不親和系制種和雄性不育系制種 ，利用甘藍(lán)雜交優(yōu)勢培育雜種 1 代。自交不親和系制種的優(yōu)勢在于操作簡便，雜種 1 代種子產(chǎn)量較高，可以同時(shí)進(jìn)行正反交。但因花期自交時(shí)出現(xiàn)嚴(yán)重結(jié)實(shí)不良現(xiàn)象，需人工蕾期自交授粉，導(dǎo)致人工成本高，雜種 1代種子純度低，而且需要多年連續(xù)自交，育種年限長；雄性不育系制種是一種重要的制種方法，其優(yōu)勢在于可以免去人工去雄 ，從而減少生產(chǎn)成本，第一代雜交種子具有更高的純度，但其不足之處在于保持系的選育和雄性不育系的培育比較困難。

游離小孢子育種通過游離小孢子在離體條件下進(jìn)行培養(yǎng)，通過胚狀體或愈傷組織的誘導(dǎo)，再生出完整的單倍體植株，完全的單倍體細(xì)胞得以再生，而后經(jīng)過誘導(dǎo)使染色體加倍 ，成為正常可育DH 系。該技術(shù)可得到純合的二倍體，消除了顯隱性基因的影響，獲得遺傳性狀穩(wěn)定的種質(zhì)，縮短育種年限 4~5 a （年）（圖 1）。該技術(shù)是一種快速獲取純系、用于作物遺傳改良的一種重要方法。

圖 1 傳統(tǒng)育種與游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)路線

1982 年，Lichter 利用游離小孢子培養(yǎng)法，首次成功地得到了油菜游離小孢子植株，在此基礎(chǔ)上，以芥菜、大白菜、白菜、甘藍(lán)和蕪菁等為材料，對其進(jìn)行了游離小孢子培養(yǎng)，并獲得了再生植株。現(xiàn)已在雜優(yōu)親本培育、常規(guī)育種、遺傳群體構(gòu)建和轉(zhuǎn)基因等研究中廣泛應(yīng)用。甘藍(lán)游離小孢子培養(yǎng)普遍存在出胚難、出胚率低等現(xiàn)象，探索提高甘藍(lán)出胚率的途徑也就成為本次研究的重點(diǎn)。由于高原地區(qū)冬季溫度低，甘藍(lán)露地越冬育種會出現(xiàn)凍死、凍傷的現(xiàn)象，成活率低，采用大棚栽培方式可以隨時(shí)控溫，使甘藍(lán)能夠很好地進(jìn)行春化、抽薹、結(jié)籽。筆者團(tuán)隊(duì)從 2017 年研究探索，初步建立了高原大棚越冬結(jié)球甘藍(lán)游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)體系，利用該技術(shù)先后選育的張甘 40、張甘 60 和張甘 65 等系列品種，居國際先進(jìn)水平，在全國廣泛推廣應(yīng)用，現(xiàn)將該技術(shù)總結(jié)如下。

1 材 料

1.1 播種

8 月中旬在溫室大棚穴盤育苗，選擇 72 穴育苗盤，通常情況下，育苗基質(zhì)一般選用草炭、蛭石、珍珠巖的配比（體積比）為 8∶1∶1，每穴 1 粒，再用蛭石覆土 ，澆透水，苗期常規(guī)管理。

1.2 整地規(guī)劃

大棚內(nèi)起壟栽培，鋪設(shè)滴灌帶，壟溝 70 cm，壟高 20 cm，壟面 30 cm。

1.3 定植

9 月中旬，小苗長到 5~6 片真葉時(shí)開始定植，每壟定植 1 行，株距 50~60 cm，標(biāo)明號碼牌，定植后澆定植水，后期田間常規(guī)管理，田間見干見濕，預(yù)防病蟲害。

1.4 春化

1 月初大棚內(nèi)開始降溫，白天將棉簾拉開一半，使溫度保持在 0~10 ℃，晚上關(guān)閉棉簾。低溫春化時(shí)間為 30~40 d，2 月中旬白天將棉簾全部拉開，開始升溫，使溫度維持在 20~25 ℃。

1.5 劃十字

春化結(jié)束后，在球頂部用小刀劃十字，深度以不傷害生長點(diǎn)、長度以外皮宜崩開為宜。

2 實(shí)驗(yàn)室準(zhǔn)備

2.1 超凈工作臺滅菌

超凈工作臺用 75%乙醇擦拭后，在紫外燈下滅菌 30 min，再進(jìn)行 30 min 通風(fēng)。

2.2 滅菌

B5 洗液：分裝到三角瓶中，每瓶 30~40 mL，用雙層透氣封口膜密封好，標(biāo)明號碼，120 ℃高壓滅菌 25 min，滅菌完成后，保存，避免粉塵污染。

NLN 培養(yǎng)液：首先用 0.45 μm 微孔濾膜抽濾 1次、0.22 μm 微孔濾膜抽濾 2 次，在超凈工作臺上用0.22 μm 微孔濾膜抽濾 1 次，分裝到三角瓶中，每瓶30~40 mL，用雙層透氣封口膜密封好，標(biāo)明號碼，保存，避免粉塵污染。

超純水：分裝到帶蓋的 500 mL 玻璃瓶中，每瓶150~200 mL，蓋子不要蓋太緊，120 ℃高壓滅菌25 min，滅菌完成后將蓋子蓋緊，標(biāo)明號碼，保存，避免粉塵污染。

3 選 蕾

因品種而異，一般 3 月初進(jìn)入初花期，選擇在09：00—10：00 采蕾，晴天或陰雨天皆可（郭世星等 、孫繼峰 研究報(bào)道低溫有利于游離小孢子的胚胎發(fā)生）。選取主枝或生長狀態(tài)較好的 1 級側(cè)枝花蕾（圖 2），大小在 4.50~5.49 mm 之間 ，裝入培養(yǎng)皿中，標(biāo)明號碼，放置在盛有冰袋的保溫箱中。因不同的甘藍(lán)品種花蕾的發(fā)育時(shí)期不同，可利用顯微鏡（25×）、坐標(biāo)紙選取單核靠邊期的花蕾（圖 3）。選蕾完成后（20 蕾左右）標(biāo)明號碼，倒入 60 目鐵絲網(wǎng)中，封口，放置于濕潤的條件下低溫保存（4 ℃冰箱）1~2 h，有利于出胚。

圖 2 主枝或生長狀態(tài)較好的 1 級側(cè)枝花蕾

圖 3 單核靠邊期的花蕾

4 花蕾消毒

將所選擇的花蕾置于一個(gè)三角形的玻璃瓶中，以 75%乙醇進(jìn)行 1 min 的滅菌，再用 0.1%的升汞進(jìn)行 8~10 min 的滅菌，最后用超純水搖晃清洗 3 次，每次 1 min。

5 抽提小孢子

將花蕾放置于玻璃管中，加入 5~7 mL B5 洗液，用玻璃棒研磨使小孢子散出，通過雙尼龍網(wǎng)過濾器將小孢子濾液注入 10 mL 離心管內(nèi)。用移液槍吸 B5 洗液沖洗過濾器中的小孢子，沖 2~3 次后，使 10 mL 離心管中小孢子懸浮液稀釋，蓋蓋，用Parafilm 膜封口，標(biāo)明名稱。

6 離 心

將小孢子懸浮液 用離心機(jī) 2000 r·min -1 離心5 min ，將離心管中的上層清液倒出，再加 10 mL B5洗液，蓋蓋，用 Parafilm 膜封口。搖晃離心管將沉淀的小孢子沖散，再次將懸浮 用離心機(jī) 2000 r·min -1離心 5 min ，倒出上層清液，再加 10 mL B5 洗液，蓋蓋 ，用 Parafilm 膜封口。搖晃離心管將小孢子 沉 淀 物（圖 4）沖散，再次將懸浮液 用離心機(jī)2000 r·min -1 離心 5 min， 倒出上層清液。

圖 4 小孢子沉淀物

7 出胚培養(yǎng)

7.1 熱激培養(yǎng)

將沉淀的小孢子用 NLN-17 [12-13] 培養(yǎng)液稀釋至淡黃色，用移液槍吸取 3 mL 分裝到 60 mm 的培養(yǎng)皿中，在培養(yǎng)皿中再注入 5 mL NLN-17 培養(yǎng)液，用Parafilm 膜封口，標(biāo)明名稱和時(shí)間。把分裝好的培養(yǎng)皿放置在 32 ℃恒溫培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng) 2~3 d（48~72 h 之間）。

7.2 置換培養(yǎng)

熱激后檢查培養(yǎng)皿中是否有出現(xiàn)污染情況，如果沒有污染，就利用倒置顯微鏡（10×）挑選出大部分膨大的游離小孢子（圖 5）培養(yǎng)皿做置換。用移液槍把懸浮培養(yǎng)液吸入離心管中離心， 用離心機(jī)2000 r·min -1 離心 5 min ，倒掉 NLN-17 懸浮液體，留下沉淀的小孢子。用 NLN-14 培養(yǎng)液稀釋沉淀的小孢子，并將其分裝入 90 mm 培養(yǎng)皿中，一般每皿加入懸浮液 5 mL 左右，再注入 5 mL NLN-14 培養(yǎng)液，用 Parafilm 膜封口，標(biāo)明名稱、時(shí)間 。

圖 5 膨大的游離小孢子

7.3 靜止培養(yǎng)

將封口的培養(yǎng)皿放置在 25 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行暗培養(yǎng)，大約 15 d 后，觀察有無明顯的白色顆粒狀胚的形成，如果沒有則繼續(xù)培養(yǎng)，如果有可見的小白點(diǎn)狀胚出現(xiàn)，則改為振蕩培養(yǎng)。

7.4 振蕩培養(yǎng)

將出現(xiàn)有一定數(shù)量小白點(diǎn)狀胚狀體（圖 6）的培養(yǎng)皿放入 60 r·min -1 25 ℃恒溫?fù)u床 上繼續(xù)進(jìn)行暗培養(yǎng)。

圖 6 小白點(diǎn)狀胚狀體

8 胚狀體成苗培養(yǎng)

8.1 誘導(dǎo)培養(yǎng)

當(dāng)暗培養(yǎng)的胚發(fā)育至子葉形胚時(shí)移入 B5固 體 培 養(yǎng) 基（B5 + Suc30 g·L -1 +Agar 10 g·L -1 +GA 3 0.1 mg · L - 1 ）上，在25 ℃ 12 h 光/12 h 暗2000 lx 光強(qiáng)條件下培養(yǎng)，進(jìn)行再生苗的誘導(dǎo)直至出現(xiàn)不定芽（圖 7）。

圖 7 分離出的不定芽

8.2 繼代培養(yǎng)

不定芽長有 2~3 片小葉時(shí)，切下不定芽，轉(zhuǎn)接到固體培養(yǎng)基（MS+ Suc 30 g· L -1 +Agar 10 g· L -1 +6-Ba0.15mg·L -1 ）中，在25 ℃ 12 h 光/12 h 暗 2000 lx光強(qiáng)條件下培養(yǎng)（圖 8）。

圖 8 植株不定芽培養(yǎng)

8.3 生根培養(yǎng)

當(dāng) 長 到 3~4 片 真 葉 時(shí) ，轉(zhuǎn) 接 到 固體培養(yǎng)基（ MS+ Suc 30 g · L - 1 +Agar10 g · L - 1 +NAA0.1 mg · L -1 ）中，在 25 ℃ 12 h 光/12 h 暗 2000 lx 光強(qiáng)條件下進(jìn)行生根培養(yǎng)（圖 9）。

圖 9 植株生根培養(yǎng)

9 植株移栽

當(dāng)獲得的植株長有 5~6 片真葉時(shí)，打開封口膜煉苗（圖 10）2~3 d 后，從試管中取出，洗凈根系（一定要清洗干凈，否則后期會有污染），移栽到花盆中，3~4 d 后連盆帶苗端到溫室中（圖 11），3~4 d 后定植到溫室里，后期常規(guī)管理，培養(yǎng)成株。

圖 10 植株煉苗

圖 11 田間定植苗

10 倍性鑒定

由于小孢子培養(yǎng)出的植株是單倍體，育性差，不能正常結(jié)籽，在育種中往往不能被直接利用，必須誘導(dǎo)進(jìn)行加倍（將含有 0.2%秋水仙堿水溶液的棉球置于單倍體植物的頂端分生組織和次生組織部位，誘導(dǎo)分生組織細(xì)胞染色體加倍）處理，使之成為雙單倍體（DH）植株。但通過誘導(dǎo)加倍的群體通常是單倍體、二倍體和多倍體組成的混合群體。通過倍性鑒定可快速獲得可用于遺傳和育種研究的大量二倍體植株。

利用流式細(xì)胞儀 可迅速準(zhǔn)確地鑒定甘藍(lán)成株材料是否為二倍體，這種檢測不受植物取材部位和時(shí)間限制。

10.1 溶液配制

溶液Ⅰ：將 4.2 g 濃度為 0.1 mol·L -1 的檸檬酸和1 mL 的 0.5%的吐溫 20 混合，將其定容至 200 mL，在 4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

溶液Ⅱ：將 28.65 g 濃度為 0.4 mol·L -1 的磷酸氫二鈉、碘化丙啶 20 mg 定容至 200 mL，在室溫下保存?zhèn)溆谩?/p>

10.2 材料處理與檢測

選取組培苗嫩葉 1 cm 2 ，放入裂解液中（200 μL溶液Ⅰ和 600 μL 溶液Ⅱ），用鋒利的雙面刀片切碎葉片，靜置 5 min 使其裂解，經(jīng)過尼龍篩網(wǎng)過濾，將所得濾液在離心機(jī)上 1000 r·min -1 離心 6 min，倒掉上清液。加入碘化丙啶染色劑，混勻，4 ℃避光靜置15 min 后，取液體加入流式細(xì)胞儀內(nèi)進(jìn)行檢測。以普通甘藍(lán)二倍體植株作對照，分離峰出現(xiàn)在熒光強(qiáng)度 200 處即為二倍體。