新型冠狀病毒SARS-CoV-2的持續變異給疾病的診斷和治療帶來了前所未有的困難。開發能有效阻斷病毒刺突蛋白受體結合域（RBD）與人類血管緊張素轉換酶 2（hACE2）相互作用的中和抑制劑，是應對疫情的關鍵策略之一。然而，病毒的快速進化使得傳統中和抑制劑的效力大打折扣，因此，迫切需要探索新的方法來開發更為有效的抑制劑，以應對病毒的突變和免疫逃逸。

近日，清華大學周小紅團隊、中國科學院微生物研究所王奇慧團隊和香港城市大學Lip Ket Chin團隊聯合在hLife上發表了題為“

De novo

圖1 新冠病毒突變株的共價抑制劑設計和應用

首先，通過分析Omicron RBD與hACE2復合物結構，識別了關鍵相互作用殘基。使用相對界面分數高于5%的熱點殘基構建肽庫，并篩選出具有最低界面分數的15-mer肽TY-K為潛在的親和肽。隨后對TY-K序列進行點突變，篩選出具有最佳對接分數的TY-F序列，并通過分子動力學（MD）模擬確定Y449、Y453和Y501殘基作為潛在的共價靶標（圖2）。進一步使用改良的Amber ff14SB力場進行MD模擬并分析驗證了共價修飾肽與Omicron RBD結合的穩定性和特異性，最終確認Y449和Y501殘基為共價結合靶標。

圖2 熱點殘基鑒定和親和肽設計

成功識別和驗證了共價結合靶標后，通過半胱氨酸殘基的巰基與4-(溴甲基)苯磺酰氟（Br-SF）之間的高效反應，合成了共價結合肽CP1-SF和CP2-SF。MALDI-TOF質譜分析確認SF基團成功引入肽段后，將其與Omicron RBD孵育，質譜結果顯示兩者形成了不可逆的共價鍵。HPLC-MS/MS分析也證實了結合肽與Omicron RBD Y449殘基之間的不可逆結合（圖3）。

圖3 共價結合肽的合成和驗證

確認了共價結合肽的結合能力之后，對其阻斷Omicron RBD與hACE2相互作用的能力進行評估。ELISA結果顯示，CP1-SF和CP2-SF分別以9.57±0.56 nM和11.25±1.16 nM的IC50值有效阻斷了Omicron BA.2 RBD與hACE2的相互作用。假病毒中和實驗中，CP1-SF和CP2-SF分別以1.07±0.03 mM和1.56±0.04 mM的IC50值實現了100%的假病毒抑制，展示了共價結合肽在阻斷Omicron BA.2假病毒感染中的高效性和特異性（圖4）。

圖4 中和活性測試

綜上，本研究展示了共價抑制劑在抗病毒藥物研發中的潛力，并且將計算設計和實驗驗證相結合，加速了新藥物的開發，此外，通過引入非天然氨基酸并同時改進MD預測力場，也為蛋白質工程和藥物設計提供了新的策略。

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作者簡介

周小紅 長聘副教授

通訊作者

機構：清華大學水環境保護教研所

研究方向：環境監測、環境污染物生物化學分析技術、生物傳感器及納米生物傳感器

王奇慧 研究員

通訊作者

機構：中國科學院微生物研究所

研究方向：病原感染與抗體藥物

Lip Ket Chin 助理教授

通訊作者

機構：香港城市大學

研究方向：納米光子學、納米等離子體學、光流體學、生物傳感器和生物醫學儀器

引用格式：Zhou X, Zhu Q, Baerlike M, et al. De novo design of covalent bonding peptides for target protein. hLife 2024; 12: 641-652.