尼帕病毒（Nipah Virus）是具有包膜的負義單鏈RNA病毒，屬于副黏病毒科（Paramyxoviridea），與埃博拉病毒是近親，其天然宿主是果蝠。1998年，尼帕病毒在馬來西亞首次爆發，感染了數百個人和動物，造成了大量的經濟損失。之后，尼帕病毒也在其他國家，例如菲律賓、印度和孟加拉，有過爆發。時至今日，印度和孟加拉依舊每年有尼帕病毒爆發的報道。尼帕病毒感染會使人患致死性腦炎，其致死率在40%～75%之間。然而，目前尚沒有可以用來預防或治療尼帕病毒感染的有效藥物或抗體。除了致死性腦炎，尼帕病毒感染者也可能是無癥狀的，這大大提高了尼帕病毒大范圍爆發的可能性，并可能威脅全球人類的安全健康。最近的研究已經揭示了尼帕病毒的RNA聚合酶結構，詳見），然而具體的催化機制細節以及抗藥性還沒有得到闡明。

近日，哈佛醫學院Jonathan Abraham團隊與波士頓大學醫學院Rachel Fearns團隊（共同一作為胡思德、Heesu Kim、楊盼）合作在Cell上發表了文章Structural and functional analysis of the Nipah virus polymerase complex(尼帕病毒聚合酶復合物的結構和功能的分析)。該研究分析了尼帕病毒聚合酶復合物（包括一個L蛋白和四個P蛋白）的結構，并利用生化實驗尋找并驗證了幾個影響尼帕病毒聚合酶復合物活性的位點。最后，利用分子動態對接（Molecular dynamics docking），他們解釋了一個藥物對多種副黏病毒的L蛋白有效但是對尼帕病毒的L蛋白無效的原因，使之有望成為藥物設計的起點。

研究團隊首先利用冷凍電鏡技術，解析了尼帕病毒聚合酶復合物NiV L-P的高分辨率的結構。在對該復合物結構進行分析的時候，他們發現了幾個特殊的位點。第一個是一段特殊的L蛋白的序列，該序列的結構在尼帕病毒的L蛋白上（氨基酸603～709）沒有被觀測到。然而通過氨基酸序列比對，他們發現相比于其他的L蛋白，NiV L的這段序列明顯較長，例如，尼帕病毒的L蛋白比埃博拉病毒的L蛋白在這一段多100多個氨基酸。由于L蛋白有一個保守的右手“大拇指-手指-手掌”（Thumb-fingers-palm）結構，而這一段序列在尼帕病毒的L蛋白中位于手掌區域，這部分序列被稱為“手掌插入”（palm insert）。

第二個是其中一個P蛋白單體（P4）的序列，被成為多肽延伸（peptide extension）。這個部分與另外一個結合在L蛋白RdRp結構域的P蛋白到XD分別位于RdRp結構域的兩側。有意思的是，這個多肽延伸在其他的副黏蛋白結構上沒有被觀測到，然而，在肺病毒科（Pneumoviridae）上可以看到其P蛋白的一部分在這個位點走勢高度一致。值得一提的是，P蛋白在不同科甚至不同屬里面都不是保守的，其序列乃至長度差別都非常大。所以這個結果表明，P4的多肽延伸可能是一個高度保守的特點。

為了研究這些特點還有一些其他的保守的解雇特點，比如鋅指結構域（zinc finger motif）和HR結構域等對L-P蛋白復合物活性的影響，該團隊利用微基因組實驗（minigenome assay）對這些突變體進行了驗證。微基因組實驗包括兩個系統，一個是多循環系統，另一個是一步復制系統。在多循環系統中，細胞可以表達T7 RNA聚合酶，在將基因組、L、P和N的基因轉化到細胞之后，T7 RNA聚合酶可以啟動L、P和N蛋白的表達，并將基因組復制以產生反義基因組。然后在L-P蛋白復合物的作用下，反義基因組可以轉錄產生mRNA或者復制產生基因組。在一步復制系統中，由于5‘短有一個突變，在這個系統中，可以利用基因組產生反義基因組和mRNA，而反義基因組不能在L-P蛋白復合物的作用下生成基因組。然后，通過RNA印記對基因組、反義基因組和mRNA進行探測，可以判斷這些突變影響的是基因組復制還是mRNA轉錄。

試驗結果表明，HR結構域、palm insert和鋅指結構域都會讓L-P復合物失去RNA合成的能力，P4 多肽延伸則會導致其活性下降為野生型的30%左右。這些結果表明，這些位點都會影響L-P復合物的活性。

有意思的是，由于其他的L蛋白的palm insert很短，如埃博拉病毒，該團隊一開始猜測palm insert不會影響其活性。然而，出乎意料的是，生化實驗表明palm insert刪除會導致L蛋白失去合成RNA的能力。這表明palm insert參與RNA合成的過程在單鏈負義RNA病毒目（Mononegavirales）的不同病毒中是不同的。換言之，雖然單鏈負義RNA病毒的聚合酶復合物大體結構類似，表明它們合成RNA的過程也大體相同，但是它們在細節上可能有較大的差別。

最后，該團隊利用分子動態對接，將GHP-88309對接到聚合酶復合物中。GHP-88309是一個廣譜到抗副黏病毒的藥物，可以抑制多種副黏病毒L蛋白的活性，然而，這個藥物對尼帕病毒無效。之前的結果表明，將NiV L蛋白的H1165突變成Y，可以讓GHP-88309的抑制效果提高60多倍。對接結果表明，GHP-88309的環氮距離H1165的咪唑基太遠（6.1 ?），不能形成氫鍵，而Y1165則將它縮短為3 ?，這使GHP-88309可以有效地與L蛋白結合。而通過AlphaFold3，該團隊預測了L-RNA的復合物的結構，這個結構則表明GHP-88309的結合位點恰好位于模版RNA出L蛋白的位置，使RNA延伸不能得以繼續下去，抑制了RNA的合成。

本研究為L-P聚合酶復合物在RNA合成中的作用提供了新見解，并且找到幾個可以影響其活性的位點，增加抗尼帕病毒的藥物設計的可能性。而分子動態對接和結構預測的結果，則合理地解釋了GHP-88309對尼帕病毒L蛋白無效的原因，接下來的研究可以利用這一結果，以GHP-88309為起點進行改造，從而實現對尼帕病毒L蛋白的有效抑制。

https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(24)01434-X

文章轉載自BioArt