SARS-CoV-2 基因組編碼的病毒蛋白中包含 16 種非結構蛋白 (nonstructural protein, NSP)，它們不直接參與組成病毒顆粒，但在病毒的生命周期中發揮重要作用。冠狀病毒感染宿主細胞后，通過病毒非結構蛋白NSP3和NSP4重塑宿主細胞的內膜系統，形成DMV(double membrane vesicle, DMV) 作為病毒的復制工廠。其復制轉錄復合物(replication-transcription complex,RTC) 錨定在DMV上，構成復制細胞器(replication organelle,RO)，以進行病毒基因組的轉錄和復制。2020年，研究人員首次發現DMV上存在膜孔復合物，并認為這些膜孔是輸出DMV內病毒RNA的通道。然而，DMV及其膜孔復合物的形成機制，以及復制轉錄復合物如何被招募到DMV上以形成復制細胞器，目前仍未完全明確。此外，關于復制轉錄復合物是定位在DMV內部還是外部也存在爭議。

2024 年 12 月 31 日，廣州實驗室徐濤院士團隊及其合作者在Journal of Cell Biology發表題為SARS-CoV-2 NSP3/4 control formation of replication organelle and recruitment of RNA polymerase NSP12的研究成果。研究團隊結合生化、分子等實驗手段，綜合利用各種先進光鏡和電鏡成像技術，揭示了 SARS-CoV-2 非結構蛋白 NSP3/4/12 在建立復制細胞器中的核心功能機制。

首先通過冷凍光電關聯成像技術證明，反式表達的NSP3和NSP4足以誘導DMV及其膜孔復合物的形成，NSP3/4是冠狀病毒誘導DMV及其膜孔復合物形成的最小功能單元。進一步深入研究NSP3/4各結構域對DMV形成的影響發現，NSP3在胞漿區域的N端和C端對DMV的形成至關重要。缺失N端的NSP3與NSP4共同誘導形成的結構類似于卷曲膜（convoluted membranes），這表明在真實病毒感染宿主細胞過程中，所觀察到的卷曲膜結構可能是由于缺失N端的NSP3與NSP4共同作用所致，而非領域內此前認為的DMV前體結構。相反，缺失C端的NSP3與NSP4則形成雙層膜的whorl樣結構（whorl-like structures）。對NSP4的C端進行研究后發現，該區域的缺失并不影響DMV的形成，但會降低DMV的數量。

研究團隊進一步研究了DMV與RTC形成病毒復制細胞器的機制，系統地分析了DMV與RTC中各組分的相互作用，發現RTC中的NSP12與DMV中的NSP3存在直接相互作用。具體而言，RTC復合物通過NSP12與NSP3的N端直接相互作用，從而被招募到DMV膜外。進一步通過熒光漂白實驗、APEX2標記電鏡和免疫電鏡都證實RTC確實定位于DMV膜外，結束了領域內的爭議。然而，關于定位于DMV膜外的RTC如何將轉錄產物雙鏈RNA（DsRNA）轉運至DMV內部的機制，仍有待進一步研究。不過，該研究發現RTC轉錄形成的DsRNA產物能夠影響并決定DMV的大小。

圖1. NSP3/4/12控制復制細胞器形成模式圖

徐濤院士課題組廣州實驗室李總紅研究員、中科院生物物理所薛艷紅正高級工程師、中科院生物物理所紀偉研究員、中科院上海感染與免疫研究所酒亞明研究員、廣州海關技術中心衛生檢疫研究所師永霞主任醫師為該論文的共同通訊作者，博士生楊金平、田步云博士、王培博士、博士生陳榕榕為論文的共同第一作者。中科院生物物理所的孫飛研究員和朱赟研究員為該研究提供了幫助。

圖2. NSP3/4 誘導DMV及其膜孔復合物的形成；NSP3在胞漿區域的N端和C端對DMV的形成至關重要；NSP4的C端缺失不影響DMV的形成，但會降低DMV的數量。

文章鏈接：https://rupress.org/jcb/article/224/3/e202306101/277189/SARS-CoV-2-NSP3-4-control-formation-of-replication

文章來源：病毒學界