近日，重慶大學醫學院羅陽教授聯合山東大學第二醫院王傳新教授、張洪博士后在《Small Methods》發表題為“Commercial Strip-inspired One-pot CRISPR-based Chip for Multiplexed Detection of Respiratory Viruses”的文章，并獲選為2025年首期封面文章。該文章以商業妊娠試紙作為結果輸出載體，構建了RECOGNIZER（Re-building commercial pregnancy strips via large-size nanoflowers）檢測體系，可在25分鐘內同時檢測4種呼吸道病毒。該體系利用具有大比表面積的DNA納米花（DNFs）用于人體絨膜促性腺激素（hCG）報告探針的高效裝載，信噪比達到10倍以上。經等溫擴增預處理后，該方法檢出限低至10 拷貝/微升，且50例臨床咽拭子樣本驗證準確率達100%。RECOGNIZER體系具有高度的可編程性，有望成為用戶友好的病毒感染監測平臺，為病毒大流行的應急救援提供技術支持。

RECOGNIZER標準檢測流程包括樣本裂解、一步法信號擴增和微流控芯片讀取，僅需25分鐘即可實現四種不同呼吸道病毒的同步檢測。

圖1.RECOGNIZER檢測原理

利用滾環擴增技術合成的DNFs呈現花狀結構，平均粒徑約為1 μm，儲存200天后仍然保持穩定。

圖2 DNFs的合成與表征

利用化學耦連將hCG蛋白標記在核酸探針上，并與DNFs雜交成功制備hCG-DNFs。相較于其他捕獲技術（如hCG-RCA，hCG-beads等），hCG-DNFs顯著提升hCG捕獲效率，且具有更高的CRISPR切割效率，信噪比超10倍。進一步構建四通道微流控芯片，可最低檢測到0.1 nM的新冠核酸樣本。

圖3 hCG-DNFs的制備與性能驗證

進一步對影響鏈置換和CRISPR切割反應的關鍵因素（如DNFs雜交比例、序列設計、緩沖液濃度、反應時間等），以達到最佳檢測靈敏度。

圖4 RECOGNIZER條件優化

在優化的反應條件下，系統地驗證了RECOGNIZER的檢測性能。RECOGNIZER對核酸片段的最低檢出限達5.42 皮摩爾。利用等溫擴增對病毒顆粒進行預擴增，RECOGNIZER可最低檢測到10拷貝/微升的病毒顆粒，滿足大規模篩查需求。與此同時，RECOGNIZER具有較高的特異性、可重復性和穩定性。50例臨床樣本檢測結果準確率達100%。

圖5 RECOGNIZER檢測性能驗證

為拓展RECOGNIZER檢測場景，研制高通量呼吸道病毒檢測芯片及讀取應用軟件，僅需簡單的加樣、掃描步驟，即可實現4種不同呼吸道病毒（新型冠狀病毒、中東呼吸系統綜合征冠狀病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒）的同步檢測，最低檢出限分別達到5.42 皮摩爾、5.85皮摩爾、4.38 皮摩爾和6.34皮摩爾。

圖6 高通量呼吸道病毒聯合檢測芯片驗證

綜上所述，本研究以商業妊娠試紙為讀取載體，構建了快速、可編程、超敏的高通量呼吸道病毒檢測平臺，極大地簡化了商業試紙條開發流程。

來源 重大檢驗

編輯 老Q