作為一個(gè)剛?cè)腴T的科研新手時(shí)， 做 PCR 都是師兄師姐把所需引物、試劑拿來，再甩出一個(gè) Protocol，照著程序性加樣、上機(jī)就行了，感覺也沒什么技術(shù)含量。輪到做自己的課題時(shí)，還真是犯了點(diǎn)愁，四處請(qǐng)教，逛論壇看各種帖子，尋找一些設(shè)計(jì)原則，最后也算形成了自己的一套流程，可以給一些還在迷茫的初學(xué)者們一些參考。

下面以（SOD1）為例，一步步演示。

基因序列查找

一般的 PCR 所需序列可以在 NCBI Gene 上，但是甲基化發(fā)揮作用主要在啟動(dòng)子區(qū)域，基因序列要包含第一外顯子的上游堿基，所以查找基因序列可以用 UCSU 的 Genome Browser（http://genome.ucsc.edu/）。

點(diǎn)擊 Genomes 選擇對(duì)應(yīng)的染色體標(biāo)本

輸入基因名稱

選擇基因轉(zhuǎn)錄本

注意一個(gè)基因可能有多個(gè)轉(zhuǎn)錄本，在 RefSeq Genes 里選擇你要查找的序號(hào)。

查看基因序列

設(shè)置參數(shù)

點(diǎn)擊 submit 便出現(xiàn)了外顯子大寫的的基因序列，可 copy 到 word 里保存供以后參考。

在線設(shè)計(jì)引物

利用甲基化設(shè)計(jì)的網(wǎng)站 Meth Primer（http://www.urogene.org/cgi-bin/methprimer/methprimer.cgi1）粘貼基因序列。

粘貼基因序列

包含第一外顯子和上游堿基的基因序列。

設(shè)置條件

查看結(jié)果

網(wǎng)站給出的幾個(gè)參考的引物相差不大，可以根據(jù)自己的需要重新設(shè)置條件來重新設(shè)計(jì)。另外可以根據(jù)一些設(shè)計(jì)引物的原則來篩選合適的引物。我也整理了一些關(guān)于引物設(shè)計(jì)的原則，供參考。

網(wǎng)站給出的幾個(gè)參考的引物相差不大，可以根據(jù)自己的需要重新設(shè)置條件來重新設(shè)計(jì)。另外可以根據(jù)一些設(shè)計(jì)引物的原則來篩選合適的引物。我也整理了一些關(guān)于引物設(shè)計(jì)的原則，供參考。

參考原則

確保目標(biāo)序列中有非 CpG 的 C 的個(gè)數(shù)。

如果你沒有足夠的 C 位于非 CpG 內(nèi)，那么未轉(zhuǎn)化的 DNA 和甲基化的 DNA 看上去會(huì)差不多，以 6～7 個(gè) CpG 為理想。如果低于這個(gè)，那么特異性會(huì)降低。你會(huì)得到非特異性的擴(kuò)增，因?yàn)樗鼌^(qū)分度不夠。

讓產(chǎn)物短一點(diǎn)

亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化的過程會(huì)損傷模板 DNA，因此嘗試擴(kuò)增較小的片段（小于 150 bp），將得到最佳的結(jié)果。如果你通過電泳來運(yùn)行產(chǎn)物，那么確保你能夠?qū)?M 引物的產(chǎn)物與 U 引物的分開。

遵守 PCR 的原則 PCR 引物設(shè)計(jì)的所有原則也適用于 MSP。

1）引物的退火溫度要相當(dāng)，如果可以的話，將 M 引物和 U 引物設(shè)計(jì)成相同的條件，這樣可同時(shí)運(yùn)行。

2）引物之間不要形成二聚體，一般引物自身連續(xù)互補(bǔ)堿基不大于 3 bp。

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