大家都在說 qRT-PCR 實驗原理、引物設計、結果解讀等，而我覺得我應該和大家分享一下 qRT-PCR 的實驗操作事項。雖小，但是關乎結果。

在做 qRT-PCR 之前，我們需要對自己的 RNA 以及操作方法有清楚的了解，畢竟我們的努力是希望得到結果的，而不是簡單的練練手。所以在做 qRT-PCR 之前，我們需要確定以下問題（部分內容僅適用于 SYBR）。

你確定你的 RNA 沒有降解嗎？

NanoDrop 2000 只能檢測 RNA 的濃度以及純度，而對于 RNA 的完整性是沒法檢測的。

RNA（RNA Intesity Number）值可以反映 RNA 的完整性，通過 Agilent 2100 Bioanalyzer system 來檢測

圖. 不同 RNA 樣本的 RIN 值示意圖（真核生物）

但是實驗室一般不會有 Agilent 2100 Bioanalyzer，在這種情況下，我們可以通過甲醛膠檢測，但是對 RNA 總量的要求高，那么最快速的方法就是用普通的凝膠電泳。要求在 nuclease-free 的環境下，所以需要將電泳槽、溶膠瓶、凝膠托槽以及梳子用 DEPC 水沖洗干凈。瓊脂糖也是 nuclease-free（只要是新開封的就行），Loading Buffer 盡可能是新開封的，配置 1.2% 的凝膠。

注意，凝膠一定要保證溶解完全，要不然會導致條帶不均一。電壓太高或者跑太長時間會產熱，導致 RNA 降解，所以要合理控制電壓和時間。此外，跑膠也可以進一步確定樣品中是否有 DNA 的殘留，觀測點膠孔是否有大量滯留的條帶。

圖. 凝膠電泳檢測 RNA

你確定你的 cDNA 的濃度嗎？

實驗室大師兄的經驗是每次反轉得到的 20 ul 體系的 cDNA 直接稀釋 20X，而博后師姐是按照 10X 稀釋，我一般是看情況而定。因為每個人提的 RNA 質量不同，反轉的水平也分高低，再說反轉的技術也未必穩定。

所以在每次拿到反轉的 cDNA 后，我首先會稀釋 3 倍左右，然后利用管家基因做一次 RT-PCR，循環數一般為 25 cycle，鑒定一下具體濃度，再決定最后的稀釋倍數。

你確定你的引物好用嗎？

可以通過 qRT-PCR 的溶解曲線，但是呢，這個還是要耗錢的。對于沒有很多錢的實驗室來說，在拿到很多引物的時候，可以通過普通的 RT-PCR 看看是否是單一條帶，鑒定一下引物的特異性。如果實驗室不差錢，則可以通過溶解曲線對所有的引物的特異性做一次鑒定。

你確定你的 PCR 板和儀器配套嗎？

如果你用的是 BIO-RAD 公司的定量 PCR 儀器，那么你一定要買配套該儀器的 qRT-PCR 板。因為不兼容的 PCR 板會導致結果偏差。因為我的師姐就真的碰到過這種情況。

你確定你的實驗條件合適嗎？

SYBR 要避免強光照射，所以在加 SYBR 試劑的時候盡量關掉頭頂的照明燈，只需借助微光完成就可以。

SYBR 放置 4 ℃ 保存，使用時輕輕上下顛倒混勻即可，避免泡沫產生，切忌用力渦旋。

有些小師妹怕自己加樣搞混，喜歡在 PCR 板上劃出標志，這樣做是不對的。因為你的標記極有可能影響到熒光信號的采集，所以一般我會建議師妹采用實驗記錄本協助記憶，如下所示。

圖.qRT-PCR 加樣圖

你確定你的操作正確嗎？

一定要戴手套，戴手套，戴手套，重要的事情說三遍。

為了減少 SYBR 在光下的曝光，個人喜歡先加入模板， 如下圖。根據經驗，少量模板的加入，容易造成加樣誤差。所以為了盡量減少加入少量模板造成的誤差，我一般會將樣本再稀釋一倍，加樣的時候多加一倍，減少 H2O2 的加入量。

圖.qRT-PCR 加樣示意圖

然后配置 qRT-PCR 體系，如下。

圖.qRT-PCR 體系配制圖

注：配置過程需在冰上完成。

加好樣品后，貼好透明封板膜。盡量不要用手碰透明封板膜的表面，從膜兩邊空余處操作就行。因為手印也有可能可能影響到熒光信號的采集。然后就是用離心機低速迅速離心 10 S，防止樣本掛壁。

好了，基本的操作部分以及注意事項就這么多，希望能幫到大家。

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