不知不覺幾年下來自己也快畢業了，感謝丁香園這些年來的幫助。沒有什么可回報的東西，就發個帖教教新人如何設計引物吧，盡量做到手把手的教，圖文并茂。

引物設計的帖子不少，以前很多戰友會推薦 Oligo、PrimerPremier、DNA man 等等軟件。這些軟件設計完最后還是要去 BLAST 比對下，所以我教大家一種易懂實用的在線設計方法，覺得好的話請投個票。

就以人的 PTEN 基因為例，首先你要找到他的基因序列，如果你要用的是 cDNA，就找它的 mRNA 序列。如果你要做的是 DNA，就找 DNA 的序列。

以 cDNA 為例，普遍的一種方法是上 PUBMED 中 GENE 欄搜索找到 cDNA 那欄，但 PUBMED 導出序列不太方便，我介紹個網站 http://asia.ensembl.org/index.html

1. 輸入目的基因，進入

2. 在左側欄選擇 TRANSCRIPT，選擇后進入

3. 選擇 PTEN-001 中的 TRANSCRIPT 進入，點擊左側 cDNA

4. 然后點擊 CONFIGURE THIS PAGE 進入設置你要顯示的內容

5. 除了第一欄 SHOWEXONS 選擇 YES 外，其他的都選擇 NO，然后取個名字保存 SAVE CONFIGURATION AS

6. 然后在左側欄點擊 DOWNLOADVIEW AS RTF 可下載你要的 cDNA 序列，這個文件可以用 WORD 打開，不同的顏色代表一個外顯子間斷

下載后打開的 WORD

7. 然后根據可以根據你感興趣的序列設計引物了，比如我在分別在第 6 和第 7 外顯子分別設計上下游引物。選取并復制第 6 和第 7 外顯子序列

8. 登陸 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/，粘貼這段序列，設置好 RANGE 和 PCR 產物的大小，然后在下面點擊 GET PRIMERS，可以在線設計并比對引物

9. 最后選擇一個比較特異性的引物，條帶大小要盡量單一，其他的基因序列盡量不要比對到

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