中國科學院生物物理研究所王祥喜研究員、饒子和院士團隊以及中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所步志高研究員、陳瑜濤副研究員作為通訊作者于2024年11月在Nature Communications上發表了題為“Transcription regulation of African swine fever virus: dual role of M1249L”的研究論文。本研究解析了非洲豬瘟病毒RNA聚合酶（vRNAP）復合物結構，闡明了pM1249L在ASFV基因轉錄調控的分子開關功能。

01

研究背景

非洲豬瘟病毒（ASFV）編碼一種獨特的不依賴于宿主的轉錄系統，該系統包括一個8亞基RNA聚合酶（vRNAP），臨時表達的轉錄因子和轉錄相關蛋白，通過中間宿主促進跨物種傳播。病毒粒子的蛋白質組成和病毒基因組中轉錄因子的存在表明在病毒感染過程中存在不同的轉錄系統。作者通過動態轉錄組分析、vRNAP相關組分分析和細胞實驗的分析，強調了M1249L在病毒轉錄調控中的關鍵作用。vRNAP-M1249L超配合物的原子分辨率結構顯示出多種構象，揭示了M1249L的雙重功能。在轉錄早期，M1249L可以作為多個臨時轉錄因子，其C端結構域作為激活/失活的開關，而在轉錄后期，它有助于轉錄機制的包裝。M1249L的結構和功能特征強調了其在ASFV轉錄、包裝和衣殼組裝中的重要作用，為治療干預提供了新的機會。

02

研究結果

結果一：M1249L在ASFV vRNAP中起著關鍵作用

為了對內源性ASFV-vRNAP復合物進行親和純化，作者以ASFV減毒疫苗候選菌株HLJ/18-6GD19為基礎，構建了在EP1242L基因上帶有C端雙鏈標簽的重組ASFV-1242TS病毒（圖1a）。使用Strep-tactin XT樹脂純化vRNAP復合物，通過SDS-PAGE分析、銀染色和MALDI-TOF質譜分析，證實了8個vRNAP亞基的存在（圖1b）。為了進行ASFV vRNAP的動態分析研究，作者從不同時間點（8/10/12/14/16/24 hpi）的PBM細胞中純化vRNAP復合物。銀染色表明M1249L與vRNAP亞基共純化，在12/16/24 hpi時獲得的純化樣品中比例增加（圖1b）。

ASFV動態轉錄組的UMAP分析顯示，病毒編碼的轉錄因子NP868R（CE）、I243L（TFIIS）、C315R（TFIIB）和B263R（TBP）作為vRNAP亞基的早期轉錄基因聚集在一起，在8 hpi處達到峰值，而轉錄因子D1133L（VETFs）、G1340L （VETFl）、Q706L （NPH-I）、病毒粒子結構蛋白p17/p72/pp62/pp220和M1249L作為晚期轉錄基因在12 hpi處達到峰值而分組在單獨的簇中（圖1c, d）。考慮到純化的ASFV顆粒中存在VETF、NPH-1和M1249L以及vRNAP亞基，并考慮到VETF和NPH-1參與了VACV vRNAP復合體的形成，作者推斷M1249L也可能參與ASFV轉錄。質譜測定表明純化后的ASFV vRNAP主要存在于兩個峰中，分子量約為400 kDa和540 kDa。考慮到M1249L的分子量（144 kDa），這些峰分別對應于ASFV 8亞基核心RNAP和RNAP M1249L復合物（圖1e）。此外，質譜測量表明，在8/10/12/14/16/24/48小時的樣品中，vRNAP M1249L復合物的比例逐漸增加（圖1f），與銀染色分析結果一致（圖1g）。

為了進一步研究M1249L的功能，作者采用了先前報道的熒光素酶報告系統，其中p72啟動子下游的熒光素酶與其他轉錄因子一起被共轉染的ASFV RNAP轉錄。作者發現M1249L與vRNAP共轉染導致vRNAP活性顯著的呈劑量依賴性增加（圖1h），表明M1249L在ASFV轉錄中起著至關重要的作用。此外，將多種轉錄因子組合與vRNAP和M1249L共轉染，結果表明，VETF的加入增強了vRNAP-M1249L復合物的轉錄活性，而NPH-I沒有其他作用（圖1i）。相反，在vRNAP中添加TBP-TFIIB-TFIIS-CE轉錄因子也增強了轉錄活性（圖1i）。

圖1. M1249L 在 ASFV vRNAP 的活性中起著至關重要的作用

結果二：ASFV核心vRNAP和vRNAP-M1249L復合物的結構測定

為了研究M1249L對vRNAP調控活性的影響，作者在48 hpi下純化了ASFV-vRNAP復合物，并以2.6 ?（PDB: 8YQT）和2.7 ?（PDB: 8YQV）的分辨率獲得了兩種狀態的vRNAP復合物的冷凍電鏡重建。為了闡明M1249L的結構細節，作者使用了三輪3D分類，產生了三種不同的重建，分辨率分別為2.6 ?（PDB: 8YQW）、2.8 ?（PDB: 8YQU）和3.7 ?（PDB: 8YQY）。為了了解vRNAP與病毒轉錄因子之間的相互作用，作者分析了在不同時間點（12/16/24 hpi）分離的ASFV vRNAP復合物。通過對收集到的所有數據進行全面的統計三維分類方法，作者識別出25種不同的重構，突出了M1249L與vRNAP結合的各種狀態（圖S4）。

圖S4. 動態ASFV vRNAP-M1249L復合物結構測定

結果三：ASFV vRNAP復合物的總體結構及其動力學

為了說明ASFV核心vRNAP的獨特特征，作者將ASFV、VACV（PDB: 6RIC）、酵母（PDB:1WCM）和豬（PDB: 7EG7）的vRNAP進行了疊加。結果顯示，ASFV vRNAP的結構更接近真核RNAP，而非其與VACV的NCLDV同源物（圖2a）。此外，作者從12/16/ 24 hpi純化的樣品中鑒定出了約30%的vRNAP顆粒活性中心附近的內源性核酸。在vRPB1和vRPB2之間的間隙中，靠近橋狀螺旋約10 ?處，觀察到內源性核酸的額外密度（圖2b）。因此，作者將一個8 bp的B型雙鏈DNA片段（來自PDB:7EG723）建模到該區域。結果表明，該模型與周圍帶正電的氨基酸殘基形成良好的靜電相互作用，特別是來自vRPB1的R301、R305、K306、R311、K828和來自vRPB2的R229、R249、K267、R269、R410。作者沒有檢測到下游/上游雙鏈DNA的密度，可能是由于雙鏈DNA進入裂縫進行鏈分離的高遷移率。

在3D分類中，發現50%的vRNAP與M1249L結合，其單粒子構成達到3.0 ?的整體分辨率。基于該圖譜進行建模，M1249L結構由6個結構域（D1-D6）組成，由非結構化連接體連接，并在vRNAP間隙的多個位點包裹vRNAP，形成一個大的埋表面積40,000 ?2（圖2c-e）。使用DALI或VAST進行結構相似性搜索，沒有發現任何結構域的同源結構，說明M1249L具有特殊的結構特征。vRPB1環通過含有三個Asp殘基的NADFDGD （aa 455-461）基序配位一個Mg2+離子，形成催化中心。值得注意的是，在vRNAP顆粒中有一個區域的催化中心未被占用，允許模板DNA雙鏈和mRNA的進入，表明處于活性狀態（圖2d）。相比之下，在vRNAP粒子的剩余區域中，M1249L的末端C尾環（殘基1227-1249）占據了催化中心內的DNA結合位點，并與Mg2+離子相互作用。這種相互作用阻斷了NTP通道，表明這些vRNAP粒子處于非活動狀態（圖2e）。

圖2. ASFV核心vRNAP和vRNAP-M1249L復合物的結構

結果四：結構比較表明M1249L多結構域具有多種轉錄因子功能

為了闡明M1249L在轉錄中的作用，作者將ASFV vRNAP-M1249L復合物與豬RNAP和VACV vRNAP的結構進行了比較和建模。根據對結構域結構、結合位點和特定氨基酸基序的分析，作者推斷M1249L的多結構域結構代表了轉錄因子類似物的組裝，包括TFIID、TFIIB、TFIIS和TFIIF（圖3-5）。

在轉錄起始階段，RNA聚合酶II（RNAP II）與啟動子的相互作用通常涉及與呈直線形態的雙鏈DNA結合。D1中一組帶正電的氨基酸，包括K95、K96、K97、R100、R102和K193，都朝向DNA主鏈，為起始前復合物（PIC）組裝過程中與模板結合做準備（圖3b）。通過與密切相關的哺乳動物PIC （PDB: 7EG7）的結構疊加，作者發現M1249L的D1位于DNA模板的上游，其環狀結構與DNA凹槽配合良好（圖3c,d）。動態圖譜顯示D1具有靈活性（圖3e），允許其在DNA彎曲過程中移位。這種靈活性至關重要，因為與VACV共轉錄加帽復合物（CCC）的對比表明，D1的結合將與CCC內的甲基轉移酶（MTase）結構域發生空間沖突（圖3f）。因此，在CCC組裝之前，DNA彎曲可能是誘導D1易位的必要條件，從而確保vRPB7的C端結構域（CTD）保持未結合狀態。正如對重組ASFV vRNAP核心的分析所表明，這種構型將使vRPB7隨后與NP868R的加帽酶（CE）結合，在vRPB7 C端MTase小亞基同源物形成CCC組裝（圖3f）。

圖3. M1249L D1結構域的結構分析揭示了其作為一種類似于TFIID的瞬時轉錄因子的作用

TFIIB通過將Pol II招募到啟動子，并通過其N端鋅帶結構域和C端B型核細胞周期蛋白折疊與DNA和TBP相互作用，在RNA轉錄起始中發揮核心作用。與人（PDB: 7EG7）、酵母（PDB: 4BBR）和VACV （PDB: 6RFL）的RNAP進行結構比較表明，M1249L的D2-D3-D4結構域與典型TFIIB的結合位置和結構相似（圖4a, b）。D2包含一個類似于TFIIB的B-ribbon的鋅指基序，隨后是B-reader/linker環，探測vRPB1“停靠”和vRPB2“混合結合”結構域之間的接口。同時，D3和D4類似于真核RNAP中發現的B型核細胞周期蛋白折疊（圖4c）。值得注意的是，D3位于RNA出口位點，必須移位以避免與正在延伸的RNA發生沖突。這與D3的低占位率（約1%）和動態圖顯示D2/D3/D4在各種組合中缺失（圖4d）是一致的。這些結果表明，在病毒轉錄過程中，M1249L中的TFIIB樣結構域會發生構象調整。在VACV中，B-core-C被一條非結構化鏈所取代（圖4b,c），表明VACV在進化上距離更遠。

圖4. 通過結構分析，M1249L D2-D4結構域被鑒定為類似于TFIIB的臨時轉錄因子

結構比較和序列分析表明，D5與人（PDB: 8A40）和酵母（PDB: 1Y1V）的RNAP中的TFIIS具有一定的相似性。與真核TFIIS類似，D5結合在漏斗的外緣（圖5a），由類似于TFIIS結構域II的螺旋束和類似于TFIIS結構域III的鋅帶折疊組成（圖5b, c）。此外，D5還包含一個酸性發夾結構，包含兩個連續的酸性殘基（D851和E852），這在TFIIS中是嚴格保守的（圖5d），并對RNA延伸和切割至關重要。然而，D5的結合位點與典型真核生物TFIIS的結合位點并不完全一致，酸性發夾的位置/方向也不完全對齊，這表明D5可能處于未觸發狀態，僅在需要延伸或回溯時才準備進入漏斗。這一假設得到了動態圖的支持，動態圖顯示酸性發夾密度相對較弱且具有彈性（圖5e）。

圖5. 對M1249L D5結構域的結構分析表明，它是一個與TFIIS相似的臨時轉錄因子

03

總結

本研究介紹了 ASFV 及其與 M1249L 復合物的內源性 vRNAP 的結構。作者的研究結果揭示了 M1249L 作為參與早期轉錄的病毒轉錄因子的多功能作用，不僅參與衣殼組裝，還在vRNAP 構建和轉錄調控中發揮作用。這些結果突出了 ASFV 特異性結構特征，并為未來控制和治療 ASFV 奠定基礎。

04

學習心得

本文深入研究了ASFV轉錄調控中M1249L的雙重作用，通過原子分辨率的結構分析和功能研究揭示了M1249L的不同構象，展示其在ASFV轉錄調控中的關鍵作用，為理解ASFV的轉錄機制提供了新的視角。我們可以進一步深入研究M1249L的功能和作用機制，以制定針對ASFV的治療干預措施。

本文作者：周慧

責任編輯：趙欽 孫亞妮

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39567541/

來源：ZhaoSunLab

如果您喜歡我們的內容，請點“贊”和“在看”

感謝您的支持和鼓勵！