近年腫瘤血管生成領域的研究不斷深入，成為國家自然科學基金的熱點話題。今天，我們將以一個 2023 年成功獲批的腫瘤血管生成研究項目為例，為大家詳細解析國自然申請書的撰寫技巧。

中標項目：LGALS1/CD276/STAT3 促進腫瘤血管生成介導膀胱癌進展的機制和功能研究

一、項目研究思路分析

LGALS1：LGALS1 是一種蛋白，全稱為半乳糖結合凝集素 1（Galectin-1）。它是一種 β-半乳糖結合的凝集素，能夠通過與多種細胞表面的糖結合，參與調控細胞的增殖、凋亡、黏附和細胞間信號傳遞等過程。在腫瘤中，LGALS1 通常被過表達，并與腫瘤的免疫逃逸、腫瘤細胞的侵襲和轉移以及腫瘤血管生成等多個方面有關，它可以促進腫瘤的進展。

CD276：CD276（B7-H3）是 B7 家族成員之一，是一種免疫檢查點分子，通常在多種類型的腫瘤細胞表面表達。它的表達與腫瘤的免疫逃避、增殖和轉移密切相關。CD276 通過與免疫系統中的受體相互作用，可以促進腫瘤細胞逃避免疫監視，進而促進腫瘤的生長和轉移。

STAT3：信號轉導和轉錄激活因子 3（Signal Transducer and Activator of Transcription 3），是 STAT 蛋白家族的成員之一，參與細胞生長、分化、凋亡和免疫調節等多個重要生物過程。在多種腫瘤中，STAT3 的持續激活與腫瘤的發生、發展密切相關，它可以促進細胞的無限增殖、抑制凋亡、促進血管生成和炎癥反應，從而有利于腫瘤的生長和轉移。

腫瘤血管生成：是指腫瘤內部新血管的形成過程，這是腫瘤生長和轉移的一個關鍵環節。腫瘤通過分泌血管生成因子（如 VEGF）等分子，促進周圍正常血管向腫瘤組織內生長，為腫瘤提供養分和氧氣，同時也為腫瘤細胞的擴散提供了通道。

在本項目中，LGALS1、CD276、STAT3 這三個分子可能形成一個或多個信號傳遞路徑，促進腫瘤血管生成和膀胱癌的進展。這些信號軸的具體調控機制可能涉及上述分子相互之間的直接或間接相互作用，以及它們與其他信號分子的相互作用，共同影響腫瘤的微環境，促進腫瘤血管的形成和腫瘤細胞的增殖、生存和遷移。

本項目的思路大致為：LGALS1、CD276 和 STAT3 通過相互作用和信號傳遞，促進腫瘤血管生成，導致膀胱癌的進展。

二、項目寫作（穿插寫作思路講解）

摘要

摘要撰寫時注意其包括以下幾個部分：

（1）疾病研究的問題（提出問題）；

（2）目前研究熱點（問題切入）；

（3）預實驗數據（提出假設的依據）；

（4）提出假設（根據研究熱點和預實驗數據，提出自己的科學假說，一句話）；

（5）擬進行研究（研究內容的縮寫，打算怎么證明或驗證假設）；

（6）研究意義。同時撰寫時嚴格把控字符數（400）

根據以上幾個要素，這里我們的摘要可以寫為：

膀胱癌是一種常見的泌尿系統惡性腫瘤，由于其高復發率和死亡率，迫切需要新型治療策略。目前，關于 LGALS1/CD276/STAT3 軸在膀胱癌血管生成中的作用及其機制研究仍然有限。我們的前期研究發現，LGALS1、CD276 和 STAT3 在膀胱癌組織中高表達，并且與患者的預后密切相關。進一步的實驗表明，這三種分子能夠促進膀胱癌細胞的血管生成。因此，我們提出科學假說：LGALS1/CD276/STAT3 軸通過促進腫瘤血管生成導致膀胱癌進展。為驗證這一假設，我們計劃在組織樣本水平、體內、體外和分子水平，利用免疫組化、小鼠異種移植模型、細胞培養和基因敲除等技術，明確 LGALS1/CD276/STAT3 軸的功能作用，闡釋其促進膀胱癌血管生成的作用機制，評價其在膀胱癌治療中的應用潛力。此研究有望揭示 LGALS1/CD276/STAT3 軸在膀胱癌進展中的關鍵作用，為開發新型膀胱癌治療策略提供理論依據。

（一）立項依據

1．項目的立項依據（研究意義、國內外研究現狀及發展動態分析，需結合科學研究發展趨勢來論述科學意義；或結合國民經濟和社會發展中迫切需要解決的關鍵科技問題來論述其應用前景。附主要參考文獻目錄）；

立項依據的撰寫主要包括幾個部分：

• 你要研究什么？即臨床問題

• 研究的意義是什么？

• 目前的國內外研究有哪些缺陷，哪些問題，從何處入手？

• 我們在前期工作中發現了什么，即預實驗，為什么我來研究這個問題最合適以及為何產生此假說？即闡明假說形成的思路過程。

• 凝練出本課題的關鍵科學問題，提出「研究假說」。簡要說明你的研究思路。

國自然基金重在科學假說的創新性、合理性、明確性、邏輯性、科學性、完善性，缺一不可。但是點到為止，既要證明該假說的合理，又不能把所有的實驗都做完，是一個拼圖游戲，所以這里面分子機制的實驗數據列舉需要有個度，預實驗達到總研究內容的 30% 左右為宜。

在撰寫立項依據時，參考文獻也需要注意以下幾點：

1. 選擇權威和有影響力的文獻；2. 引用最新的研究成果：近 3 年，不可引用太老的文章，且需引用幾篇申請當年發表的文獻；3 引用適量的文獻：在立項依據中，不要過度引用文獻，也不要過于依賴文獻堆砌，青年、地區 30 篇左右，面上 40 篇左右即可。

在這里，我們可以寫做：

1.1 研究意義：揭示新型治療靶點對抗膀胱癌進展的重要性

這一部分應當介紹為什么研究膀胱癌的新型治療靶點是重要的?？梢杂懻摪螂装┑牧餍胁W數據，目前的治療方法以及它們的局限性，從而強調開發新治療方法的迫切需要和潛在影響。

1.2 LGALS1/CD276/STAT3 軸的高表達與膀胱癌患者預后負相關

在這部分，應詳細介紹 LGALS1、CD276 和 STAT3 三個基因/蛋白在膀胱癌中的表達情況以及它們如何與患者的預后相關聯?？梢酝ㄟ^回顧相關文獻和研究，展示這一軸線如何影響膀胱癌患者的生存率和疾病進展。

1.3 LGALS1/CD276/STAT3 軸促進膀胱癌細胞血管生成

這部分應聚焦于如何 LGALS1/CD276/STAT3 軸通過促進血管生成來影響膀胱癌的發展。可以探討這一信號通路的生物學機制，以及它如何促進腫瘤微環境中的血管形成，進而支持腫瘤生長和擴散。

1.4 腫瘤血管生成增強促進膀胱癌進展

這一節應詳細闡述腫瘤血管生成（即血管新生）對于膀胱癌進展的作用。介紹血管新生的生物學基礎，如何為腫瘤提供必需的養分和氧氣，以及這如何與膀胱癌的侵襲性和轉移能力相關聯。

1.5 本項目的科學假說和后續研究計劃

最后一部分應提出本研究的科學假說，并詳細描述后續的研究計劃。包括預計采用的實驗設計、預期結果及其對膀胱癌治療可能產生的影響。此外，還應該討論假設驗證的方法，如果假設成立，可能對治療膀胱癌的策略帶來哪些新的見解。

（二）研究目標

研究目標的撰寫注意以下幾點：

①目標清晰，層次分明，只寫目標，不用再重復研究意義、用什么方法研究，且目標具體，可實現。

② 突出科學性。

③內容詳盡，覆蓋到所有的擬解決的科學問題。

可按照明確 …… 關系；揭示 …… 規律；理解 …… 作用；闡明 …… 機制等的模板撰寫

以本項目為例，研究目標可寫做：

1. 明確 LGALS1/CD276/STAT3 信號軸在膀胱癌中的表達關系及其與疾病嚴重程度之間的相關性。

2. 揭示 LGALS1/CD276/STAT3 軸促進腫瘤血管生成的分子機制和信號通路。

3. 理解 LGALS1/CD276/STAT3 信號軸在膀胱癌進展中的整體作用及其作為治療靶點的潛力。

（三）研究內容

研究內容的撰寫需注意是為了達成研究目標而要去做的研究，與研究目標呼應，為具體研究方案的框架，撰寫過程中可按照臨床樣本、動物水平、細胞水平分層次撰寫，闡明做什么事達成什么目的。同時明確細胞、動物模型的選擇和構建。

那么，該如何撰寫呢？我們這里以圖文的形式為大家展現（注意，這里的配圖僅是為了大家直觀地理解研究內容的寫作，并非是技術路線圖，實際的標書中研究內容部分并不需要該圖）

1、臨床研究

在本研究的臨床部分，將收集 100 例膀胱癌患者的新鮮腫瘤組織樣本及相應非腫瘤對照組織。通過免疫組化（IHC）和免疫熒光技術，檢測 LGALS1、CD276 和 STAT3 蛋白的表達，評估它們在膀胱癌組織中的定位和表達水平。此外，將使用流式細胞術分析腫瘤微環境中免疫細胞的組成，尤其是 T 細胞和巨噬細胞的亞群，探究免疫微環境與腫瘤進展的關系。通過定量 PCR 和 Western blot 進一步驗證 LGALS1、CD276 和 STAT3 的 mRNA 和蛋白水平，以及它們在腫瘤進展中的表達動態。

2、動物研究

使用 NOD-SCID 小鼠，通過尾靜脈注射 T24 或 5637 膀胱癌細胞株構建膀胱癌模型。動物分為四組：對照組、敲除 LGALS1 組、敲除 CD276 組以及 STAT3 敲除組。應用 CRISPR/Cas9 技術進行基因編輯。將通過免疫組化分析血管內皮細胞標志物 CD31 和平滑肌肌動蛋白 α-SMA 來定量血管生成和腫瘤間質變化，使用超聲成像技術評估腫瘤大小及血流情況，為評估腫瘤血管生成提供直觀的生理信息。通過 EdU 增殖檢測評估細胞增殖活性。通過 TUNEL 檢測評估細胞凋亡。通過 HE 染色評估組織形態，通過染色組織切片觀察腫瘤的細胞結構和組織構造。計算腫瘤體積，通過定期測量腫瘤的三維尺寸估算其體積，以評估腫瘤生長的速度和模式。

3、細胞研究

選擇 T24、5637 和 UM-UC-3 膀胱癌細胞系進行細胞實驗，分為：對照組、LGALS1 敲除組、CD276 敲除組、STAT3 敲除組以及挽救實驗組：LGALS1 敲除后 CD276 過表達組及 CD276 敲除后 STAT3 過表達組。利用 CRISPR/Cas9 技術敲除基因，并通過慢病毒轉染技術恢復基因表達。細胞功能實驗包括 CCK-8 細胞增殖實驗、流式細胞術檢測細胞凋亡，以及實時細胞分析儀（RTCA）評估細胞遷移和侵襲能力。此外，通過 Matrigel 基質膠進行管型形成實驗，結合 VEGF 和 bFGF 的 ELISA 分析，全面評估細胞的血管生成能力。

4、分子機制研究

利用 RNA 干擾技術（RNAi）、CRISPR/Cas9 基因編輯技術精確調控 LGALS1、CD276 和 STAT3 的表達，并結合定點突變技術探討這些因子在膀胱癌中的作用。特別關注它們如何通過促進血管生成和腫瘤細胞的增殖來影響膀胱癌的進展。使用質譜分析檢測蛋白質的修飾和相互作用，理解信號傳導途徑的動態變化和調控機制。ChIP-seq 分析研究蛋白-DNA 相互作用，尤其是轉錄因子如 STAT3 在基因表達調控中的作用。單細胞 RNA 測序分析細胞異質性和基因表達，提供對腫瘤細胞群體內部復雜性的深入視角。通過大數據分析識別關鍵的信號調控網絡，評估它們在腫瘤進展中的作用。

（四）擬解決的科學問題

關鍵科學問題的撰寫需要凝練出本項目的重點難點問題，同時與研究目標、研究內容相呼應，使得研究目標就是去解決這個問題，而研究內容就是解決這個問題的方式。撰寫中在提出科學問題之后還要解釋一下為什么這是關鍵科學問題；并給出解決方案，如何去解決這個問題。

在青年、地區項目中，關鍵科學問題通常寫 2 個即可，面上則撰寫 3 個為宜。

具體如何撰寫呢？

1. 明確 LGALS1/CD276/STAT3 軸在促進腫瘤血管生成中的具體功能是本項目擬解決的關鍵科學問題之一。

這一問題的關鍵性在于，盡管已知該信號軸與膀胱癌進展相關，但其在腫瘤血管生成中的確切作用及作用機制尚未清晰。本項目擬通過細胞功能實驗（如管型形成、遷移和侵襲實驗）、動物模型（如裸鼠異種移植模型）和免疫組織化學分析，證實 LGALS1/CD276/STAT3 軸對腫瘤血管生成的促進作用。

2. 闡明 LGALS1/CD276/STAT3 軸促進腫瘤血管生成的分子機制是本項目擬解決的關鍵科學問題之二。

解析這一機制對于揭示膀胱癌發展的新機理和發現新的治療靶點至關重要。本項目擬通過實時熒光定量 PCR（qRT-PCR）、Western blot 分析和雙熒光素酶報告基因實驗，探索 LGALS1/CD276/STAT3 軸在細胞內的信號傳遞路徑和關鍵下游效應分子。

3. 揭示 LGALS1/CD276/STAT3 軸作為膀胱癌治療新靶點的潛力是本項目擬解決的關鍵科學問題之三。

鑒于膀胱癌治療的迫切需求，發現新的治療靶點具有重要的臨床意義。本項目擬通過藥物敏感性測試（細胞存活率實驗）、基因敲除或過表達后的動物模型研究，以及免疫組織化學評估治療后腫瘤組織的血管密度變化，評估靶向 LGALS1/CD276/STAT3 軸的治療干預對腫瘤血管生成和膀胱癌進展的影響，證實其作為治療靶點的應用潛力。

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