體檢時的抽血、新冠疫情期間的核酸檢測、流感暴發(fā)時的抗原檢測幫助我們快速、準確地確診疾病，從而使患者及時接受治療。這些檢測的背后少不了酶的神奇作用，因此，對酶的創(chuàng)新研發(fā)重要性不言而喻。

體外診斷是我們?nèi)粘＞歪t(yī)中常用的檢測方法，是指將血液、體液、組織等標本從人體中取出，使用體外檢測試劑、試劑盒或儀器等對標本進行檢測與校驗。70%以上的醫(yī)療決策都源于體外診斷，因此，體外診斷又被稱為醫(yī)生的“眼睛”，對疾病的防控和治療具有不可替代的重要意義。

對體外診斷來說，酶是其核心反應體系中不可或缺的成分。酶是由活細胞產(chǎn)生的、存在于生物體內(nèi)的一種生物催化劑。每一種生物在生命過程中，從小到大，繁衍生息，生老病死，新陳代謝，都和酶有關，可以說沒有酶也就沒有生命。早在4 000多年前，我國古代人民就開始利用大麥芽中的酶制造飴糖，利用發(fā)酵法釀酒、制醋，但那時人們并不知道酶為何物。后來，隨著人們對酶的認識的不斷加深，酶學、酶工程、酶的應用不斷邁向新的紀元。

一直以來，體外診斷核心酶產(chǎn)品研制多源自歐美發(fā)達國家，我國診斷試劑中的核心酶原料嚴重依賴進口，導致檢測成本居高不下。

蛋白酶K：重壓之下突破國外壟斷

2020年新冠疫情暴發(fā)期間，以蛋白酶K為代表的核心原材料被美國政府列為戰(zhàn)略防控物資，造成了對我國的供貨中斷，嚴重影響了新冠核酸診斷試劑的生產(chǎn)。因此，診斷酶制劑國產(chǎn)化及應用成為我國突破國外壟斷和限制的迫切需求。

新冠病毒核酸提取過程主要包括裂解和純化兩大步驟：首先是裂解，即破壞樣品細胞結構，從而使樣品中的核酸游離在裂解體系中的過程；然后是純化，即使核酸與裂解體系中的其他成分，如蛋白質(zhì)、鹽及其他雜質(zhì)徹底分離，這一反應過程需要蛋白酶K的參與。蛋白酶K是一種從白色念珠菌分離出來的強力蛋白溶解酶，在病毒核酸檢測中，蛋白酶K可以裂解病毒的外殼蛋白并使其失活，同時將病毒基因組釋放，完成核酸抽提。

多年來，上海交通大學生命科學技術學院教授馮雁團隊致力于攻破以蛋白酶K為代表的診斷核心酶產(chǎn)品國產(chǎn)化關鍵技術，發(fā)展了酶分子進化工程技術體系，形成了診斷酶尤其是新冠病毒診斷酶制備工藝提升、生物檢測應用等重要成果，極大縮短了蛋白酶K性能改造的研發(fā)周期，酶活力和穩(wěn)定性達到國際先進水平，成本較傳統(tǒng)技術降低了50%，以穩(wěn)高產(chǎn)實現(xiàn)了3個月國產(chǎn)診斷酶規(guī)模化替代國外產(chǎn)品的“中國速度”。

Argonaute核酸酶：可編程的核酸快檢

核酸檢測在傳染性疾病診療中發(fā)揮著重要作用, 目前對高靈敏度、快速、居家檢測的需求尤為迫切，以解決專業(yè)人員短缺、檢測結果等候時間長和檢測可靠性低等問題。

近年來，以CRISPR為代表的基因編輯酶（Cas12/13）核酸檢測技術，解決了核酸檢測中的假陽性、可視化等問題，被譽為“下一代分子診斷技術”。然而，該體系存在RNA引導鏈合成昂貴且易降解、多重檢測反應體系復雜等諸多問題，限制了其臨床應用。馮雁團隊利用高溫菌Argonaute（簡稱Ago）基因編輯酶的級聯(lián)剪切機制，結合快速等溫擴增，建立了新型多重快速核酸檢測平臺技術——MULAN，實現(xiàn)了新冠及流感病毒樣本的高靈敏度、高特異性、快速的便攜式檢測。

Ago是一種靶向剪切DNA的基因編輯酶，它采用短DNA引導鏈對互補靶標鏈進行特異性剪切。馮雁團隊發(fā)現(xiàn)Ago具有級聯(lián)剪切活性，即在初始DNA引導鏈指導下的剪切產(chǎn)物可進一步指導互補單鏈DNA的剪切。研究人員先對病毒DNA進行擴增，然后利用Ago的特點，先設計兩條與擴增產(chǎn)物互補的DNA引導鏈，Ago在這兩條引導鏈的幫助下定位并進行初次剪切，得到剪切產(chǎn)物。接下來，研究人員還要設計一條與剪切產(chǎn)物互補的熒光信標DNA，其上標記著熒光基團。此時，之前得到的剪切產(chǎn)物搖身一變成為新的引導鏈，在其引導下，Ago對熒光信標DNA進行次級剪切，從而釋放熒光信號，顯示檢測結果。

隨后，研究人員以3種不同的傳染病病毒為檢測對象，設計3組不同的特異性DNA引導鏈，實現(xiàn)了單酶對多病毒的精準識別。

與現(xiàn)有的檢測技術相比，MULAN具有快速、準確、經(jīng)濟的優(yōu)勢，尤其是多重檢測的簡便性和安全性優(yōu)于目前報道的CRISPR檢測技術，且對PCR儀等昂貴儀器設備依賴較低。

酶是生物體內(nèi)的自然法寶，馮雁團隊數(shù)十年如一日地雕琢這件法寶，對其充分利用、不斷開發(fā)，把診斷酶的制備工藝牢牢掌握在中國人自己手中，使體外診斷變得更加高效、經(jīng)濟。這不僅對傳染病診療產(chǎn)生積極影響，也將對重大疾病防控提供理論和技術支撐。

本文相關成果“以蛋白酶K為代表的診斷核心酶產(chǎn)品自主創(chuàng)制與國產(chǎn)化關鍵技術”榮獲2022年度上海市技術發(fā)明獎一等獎。

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