B組柯薩奇病毒（CVB）是病毒性心肌炎、腦膜炎和胰腺炎等嚴重疾病的主要致病病原體。由于對CVB的發病機制尚不清晰，目前仍缺少有效的抗病毒治療措施。泛素化是蛋白翻譯后修飾最普遍的形式之一，幾乎涉及到所有的細胞進程。由于泛素化的普遍性和重要性，許多病毒進化出獨特的機制來干擾宿主泛素化依賴的信號傳導或利用泛素化來逃避先天免疫繼繼而促進病毒感染。有研究報道顯示，CVB可利用宿主泛素化促進復制，但相關機制仍未被完全闡明。

近日，哈爾濱醫科大學趙文然教授聯合鐘照華教授課題組發現E3泛素連接酶TRIM56可以介導CVB3 3D蛋白的泛素化和蛋白酶體降解，提示TRIM56是抗CVB感染的內在細胞因子，有望作為控制CVB感染的潛在策略。相關結果以題為"TRIM56 restricts Coxsackievirus B infection by mediating the ubiquitination of viral RNA dependent RNA polymerase 3D"在線發表于國際高水平期刊 《PLOS PATHOGENS》。

在本研究中，作者首先通過Western blot實驗對CVB3 3D蛋白是否被泛素化修飾進行驗證。值得注意的是，在CVB翻譯的過程中會產生數個前體蛋白如3AB、3BCD，3ABC（Fig.1A）。因此，可被3D抗體檢測的除了3D蛋白自身外也包括這些前體蛋白。這意味著Western blot 呈現的高分子量的3D蛋白不一定是被泛素化修飾的3D蛋白。為了確定3D蛋白的泛素化情況，作者使用CVB感染HeLa細胞后12h時候進行檢測。發現大量大于58kDa（3D單體分子量）的蛋白，這些蛋白可能為泛素化的3D蛋白或是含有3D的病毒前體蛋白（Fig.1B）。為了排除前體蛋白的干擾，作者進一步使用3C抗體進行檢測，發現可檢測到72~100kDa范圍的條帶，這表明該范圍內可同時被3C和3D抗體檢測的蛋白是由3D和3C共同組成的前體蛋白（如3CD，3BCD以及3ABCD）。該結果同時表明，高于180kDa的蛋白不含有3C。進一步的變性co-ip實驗發現，3D可以與泛素鏈連接，繼而以高分子量（大于180kDa）形式存在，而3C蛋白則不會發生泛素化修飾，以上結果證明泛素化修飾僅發生在3D蛋白，而不是包含3D的前體蛋白。

Fig 1. The RNApolymerase 3D of CVB3 is polyubiquitinated.

隨后，作者對CVB 3D蛋白連接的泛素鏈的類型進行檢測，發現3D受到k48相關的多泛素化和蛋白酶體降解。為了確定3D蛋白中與泛素鏈連接的殘基，作者構建了四個切斷的3D蛋白質粒（ 1–83, 84–187, 188–340, 和 341–462），通過對不同截短3D的分子量進行檢測發現泛素化修飾發生在 3D 的188-340區域內的K220殘基上（Fig 2）。

Fig 2. CVB3 3D is polyubiquitinated at K220.

在確定CVB3的3D泛素化后，作者對負責3D泛素化的E3連接酶進行檢測。通過提取感染CVB的HeLa細胞的總蛋白進行質譜分析，發現TRIM56在感染CVB3的細胞中顯著增加，而大多數TRIMs保持不變 （Fig 4A）。隨后，為了驗證質譜的數據，作者又分別在感染CVB的細胞和小鼠中檢測TRIM56的mRNA和蛋白表達水平，結果顯示TRIM56 mRNA和蛋白水平顯著升高（Fig 4B-K）。

Fig 3. E3 ligase TRIM56 is up-regulated in response to CVB3 infection

co-ip和激光共聚焦實驗則進一步表明3D與TRIM56存在相互作用和共定位，且TRIM56可促進3D降解(Fig 4)。

Fig 4.TRIM56 colocalizes with the 3D protein of CVB3

最后，作者對CVB3是如何克服TRIM56的限制進行了探究。由于小RNA病毒的蛋白酶會降解細胞蛋白來對抗宿主的抗病毒防御，因此，作者假設TRIM56也可能被CVB3自身的蛋白酶切割。在排除caspase對TRIM56的切割后，作者通過一系列的酶切實驗最終確定CVB的3C蛋白酶可以與TRIM56相互作用并負責對TRIM56進行切割（Fig 5）。

Fig 5. TRIM56is cleaved by the 3C protease of CVB3.

總的來說，本研究表明TRIM56是抗CVB感染的細胞限制因子，而促進病毒蛋白降解可能是控制CVB感染的潛在策略。

本文鏈接：https://journals.plos.org/plospathogens/article?id=10.1371/journal.ppat.1012594

本期編輯：小黃