前言：之前的一篇寫了NK細(xì)胞結(jié)合器（NK Cell Engagers，NKCE）激活靶點(diǎn)的選擇。 靶點(diǎn)決定了NK細(xì)胞活化的強(qiáng)度、持久性及被激活的NK細(xì)胞亞群。（感興趣的讀者可以查看《》）

但NKCE在臨床的最終目標(biāo)是具有功能強(qiáng)效和生產(chǎn)使用方便，這兩個(gè)方面都受到NKCE藥物分子結(jié)構(gòu)的影響。

以下，我們討論在藥物設(shè)計(jì)的角度，影響NKCE功能和生產(chǎn)的幾個(gè)關(guān)鍵考量。

01

免疫突觸

NK和腫瘤細(xì)胞間形成免疫突觸（Immune synapse，IS）是NK清除腫瘤細(xì)胞的前提。 NKCE進(jìn)入體內(nèi)后，可以接NK和靶細(xì)胞，促進(jìn)IS的形成，隨后通過受體結(jié)合，觸發(fā)發(fā)NK細(xì)胞的激活，最終裂解腫瘤細(xì)胞。

突觸間隙具有一定的空間限制，大多數(shù)生理性IS的突觸距離約為10-30 nm。 超過此大小的分子從無法進(jìn)入突觸間隙，那就更談不上誘導(dǎo)IS的形成。

因此，NKCE的大小對(duì)于穩(wěn)定IS形成至關(guān)重要。例如，與CD19比，CD20在細(xì)胞表面突出程度較低，在構(gòu)建靶向CD19和CD20的NKCE時(shí)可能需不同設(shè)計(jì)，即使兩種抗原均在相同B細(xì)胞上表達(dá)并均募集NK細(xì)胞。

單克隆抗體的直徑約為10nm，非常適合IS的大小。然而 ，在NKCE設(shè)計(jì)中會(huì)添加多個(gè)功能片段，從而實(shí)現(xiàn)多特異性或多價(jià)，這不可避免地會(huì)增加藥物分子的大小，因此在設(shè)計(jì)中需要綜合考量分子大小的限制。

此外，在IS的形成的早期階段，NK受體的高效聚集對(duì)于IS形成和NK 活化至關(guān)重要。在設(shè)計(jì)上，增強(qiáng)抗體的化合價(jià)可以通過增加親和力來潛在地改善靶標(biāo)結(jié)合。

腫瘤細(xì)胞表面抗原的下調(diào)是免疫逃逸的機(jī)制，如MM細(xì)胞中BCMA的下調(diào)。脫落的BCMA成為可溶性抗原，甚至能與膜結(jié)合的BCMA競爭結(jié)合NKCE并降低其功效。

02

NKCE的分子設(shè)計(jì)

目前，NKCE的分子設(shè)計(jì)通常參考T細(xì)胞接合器（TCE），畢竟二者的底層邏輯一致，而且TCE在臨床的使用更加成熟。

據(jù)分子結(jié)構(gòu)，NKCE大致可分片段化和IgG型兩大類。由于片段結(jié)構(gòu)沒有Fc，通常比IgG形式更小。

2.1片段分子設(shè)計(jì)

大多片段結(jié)構(gòu)基于IgG的重鏈（H）和輕鏈（L）可變（V）區(qū)設(shè)計(jì)，并且通常不涉及抗體的恒定區(qū)。 不同V區(qū)之間通過Linker鏈接（通常是VH和VL）形成scFv，并構(gòu)建NKCE。

在片段分子設(shè)計(jì)中，如何保證片段NKCE分子正確的包裝和折疊尤為重要。 這中間，兩個(gè)V區(qū)間的Linker決定配對(duì)的成功與否。

少于10個(gè)氨基酸的Linker通常不允許V區(qū)旋轉(zhuǎn)和折疊，導(dǎo)致鏈間配對(duì)。 研究表明，scFv的Linker應(yīng)至少3.5nm，才能允許兩個(gè)V區(qū)正確組裝成scFv。

典型的Linker是柔性和親水的，可最大限度減少胞內(nèi)蛋白折疊過程中的結(jié)構(gòu)干擾。在實(shí)踐中，藥物設(shè)計(jì)有幾種Linker比較常用，如（G4S/G3S） n 、218s或HMA。

其中 （G4S）n最常用，因?yàn)樗哂懈呷犴g性、低免疫原性以及絲氨酸殘基可以增強(qiáng)溶解度 的特點(diǎn)。此外，218s的蛋白水解穩(wěn)定性更高，聚集減少，而HMA則表現(xiàn)出較低免疫原性。

除了Linker外，次級(jí)鍵（如，二硫鍵）對(duì)成功組裝片段型NKCE也至關(guān)重要。在三體形式中，重鏈和輕鏈之間的二硫鍵促進(jìn)了配對(duì)。此外，在結(jié)構(gòu)域間引入二硫鍵有助于工程化IgG的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。

2.2改造的IgG形式

改造的IgG形式NKCE保留了Fc區(qū)，因此分在大小比片段形式要大。此類NKCE的典型工程方法包括改變IgG骨架的一個(gè)臂的特異性，或?qū)⒖乖R(shí)別部分（scFv 或 Fab）添加到基礎(chǔ)IgG的N端或C端。

根據(jù)修飾的位置，改造的IgG，可進(jìn)一步細(xì)分為不對(duì)稱和對(duì)稱類型。

不對(duì)稱 IgG形式的 N KCE 在蛋白質(zhì)折疊 中面對(duì) 更多挑戰(zhàn)。 主要是生產(chǎn)過程中的同源二聚化及輕重鏈錯(cuò)配。目前 ，已有多種技術(shù)來克服這些問題。

對(duì)稱的IgG形式可輕松規(guī)避不對(duì)稱IgG固有的鏈配對(duì)問題，從而可能降低生產(chǎn)成本。 然而，對(duì)稱IgG如果想實(shí)現(xiàn)多特異性時(shí)，它們的大小要比不對(duì)稱形式大得多。

還有，抗原識(shí)別部分（Fab 或者scFv）的選擇也會(huì)顯著影響NKCEs的功能。盡管Fab在輕重鏈正確配對(duì)方面存在挑戰(zhàn)，但它在功能上比scFv更有效。

2.3其他形式

納米抗體，也稱VHH，是NKCE構(gòu)建中非常好用的一個(gè)結(jié)構(gòu)模塊。 與scFv/Fab不同，納米抗體僅使用重鏈即可實(shí)現(xiàn)特異性抗原結(jié)合。 因此，納米抗體可 規(guī)避 配對(duì)和折疊 問 題 ，使其成為 NK CE 設(shè)計(jì) 的重要選擇。

最近出現(xiàn)了一種稱為Affibody的新型抗原識(shí)別分子其結(jié)構(gòu)是 大小約為7 kDa的三螺旋亞結(jié)構(gòu)，這也是NKCE設(shè)計(jì)中的備選結(jié)構(gòu)選擇 。

03

影響NKCE功能的其他因素

除了分子機(jī)構(gòu)設(shè)計(jì)對(duì)NKCE功能有直接影響外，在NKCE開發(fā)中還應(yīng)考慮其他因素，如組織浸潤、持久性，這些因素可顯著影響NKCE的療效。

目前大多臨床前的NKCE都是片段化的結(jié)構(gòu)，它們分子量較?。?0-100 kDa），因此具有出色的組織浸潤特性和極低的免疫原性。然而，由于腎臟清除和降解，這些小尺寸的NKCE通常缺乏體內(nèi)持久性，需要頻繁輸注以維持有效的藥物水平（復(fù)雜的給藥步驟設(shè)計(jì)也是醫(yī)生比較頭疼的），這將增加治療費(fèi)用和患者的依從性。

因此，需要既定策略延長這些小尺寸NKCE的半衰期。這些方法也是藥物設(shè)計(jì)中常用的辦法。如與血清蛋白結(jié)合或融合（半衰期2-4周），或?qū)⑺鼈兣cFc偶聯(lián)。 將小尺寸NKCE連接到化學(xué)聚乙二醇（PEG）上，也可以延長半衰期。將片段結(jié)構(gòu)的 NKCE進(jìn)行多聚化以增加其大小也是一種解決方案， 如，AFM13是二聚化兩個(gè)V結(jié)構(gòu)域來構(gòu)建的。

改造后的IgG形式NKCE通常具有更大分子量，常超150 kDa。雖然較大尺寸會(huì)給組織滲透帶來挑戰(zhàn)，但Fc區(qū)可以顯著增強(qiáng)它們的半衰期。

此外，F(xiàn)c區(qū)域可以募集除了NK細(xì)胞外的免疫胞，誘發(fā)ADCC、補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性（CDC）和抗體依賴性細(xì)胞吞噬作用（ADCP）等機(jī)制，從而增加對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷。

改造IgG的多特異性常用具有不同抗原特異性的識(shí)別區(qū)添加到IgG蛋白C 端或N端。這不可避免地增加了其分子大小，使組織滲透更具挑戰(zhàn)性，并可能增強(qiáng)免疫原性。

因此，平衡多特異性、組織滲透性和低免疫原性對(duì)于開發(fā)改造IgG形式的 NKCE至關(guān)重要。

04

NKCE的生產(chǎn)制造

NKCE的生產(chǎn)系統(tǒng)選擇也是一個(gè)重要因素，它決定了NKCE的產(chǎn)量和下游工藝的復(fù)雜性和成本。

最常采用兩種宿主系統(tǒng)：細(xì)菌系統(tǒng)和哺乳動(dòng)物系統(tǒng)。細(xì)菌系統(tǒng)通常用于產(chǎn)生片段化的NKCE，如linked-scFv 型 NKCE。改造的IgG主要在哺乳動(dòng)物細(xì)胞（如CHO細(xì)胞）中生產(chǎn)，因?yàn)樾枰g后加工才能成功鏈配對(duì)。

細(xì)菌系統(tǒng)的特點(diǎn)是廉價(jià)、快速和大批量生產(chǎn)，但生產(chǎn)的蛋白質(zhì)通常需要重新折疊。帶有NKCE基因的表達(dá)質(zhì)粒被轉(zhuǎn)化到大腸桿菌，當(dāng)細(xì)菌培養(yǎng)物達(dá)到高密度時(shí)，誘導(dǎo)NKCE表達(dá)，并通過包涵體產(chǎn)生NKCE蛋白。從細(xì)菌系統(tǒng)收集原始NKCE蛋白通常需要1-2 天，然后又需要2-3天進(jìn)行復(fù)性和純化。

在哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)（如HEK 293T 或 CHO細(xì)胞）中表達(dá) NKCE 可以繞過復(fù)性，因?yàn)檫@些細(xì)胞可以通過上清分泌功正確折疊的NKCE。

然而，哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)的產(chǎn)量通常低于細(xì)菌系統(tǒng)的產(chǎn)量。通常，哺乳動(dòng)物細(xì)胞與編碼輕鏈或重鏈的表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)。培養(yǎng)約6天后，收集上清液純化NKCEs，然后分析鏈大小和配對(duì)。

本文參考文獻(xiàn)還有幾家在開發(fā) NKCE 的公司資料都已上傳星球～