本文作者：滄漠的余燼

再生元近期在Cell reports medicine發(fā)布了一篇文獻(xiàn)，對(duì)他們?cè)O(shè)計(jì)的一款PD1-IL2Rα-IL2融合蛋白相關(guān)研究進(jìn)行了描述。

對(duì)比信達(dá)那篇“毫無誠意”、離成品IBI363十萬八千里的Nature，再生元這次在文章里可以說下足了料。

鑒于分析這篇文章的高手已經(jīng)很多，今天咱們聊一點(diǎn)輕松的，通過這篇非常扎實(shí)的文獻(xiàn)里、豐富的內(nèi)容、以及精心挑選的一部分圖片，對(duì)它的這條關(guān)心的研發(fā)思路與分子特征行專業(yè)的解構(gòu)！

1、融合蛋白概念

首先，映入眼簾的是這張，看似簡單，實(shí)則也不太復(fù)雜的圖，定為圖1：

再生元融合蛋白的設(shè)計(jì)是在抗體的Fc兩條鏈的末端通過Linker串聯(lián)IL-2受體α，然后再串聯(lián)IL-2蛋白分子。

這樣的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)，使得末端IL-Rα和互補(bǔ)鏈的IL-2結(jié)合，此時(shí)IL-2被結(jié)合，不發(fā)揮生物學(xué)功能，正所謂Mask的掩蔽狀態(tài)。

但由于IL-2R和IL-2的結(jié)合并非永恒的，因此還存在一種解離的狀態(tài)，Unmask的非掩蔽狀態(tài)，這種狀態(tài)下，IL-2分子是有作用的。

這種融合蛋白在Mask?unMask之間動(dòng)態(tài)轉(zhuǎn)換，但是大部分時(shí)間是無功能的Mask狀態(tài)，少部分時(shí)間是IL-2有功能的unMask狀態(tài)。

基于上述原理，在非靶向的情況下NT-IL2Ra-IL2不激活STAT5，即此時(shí)IL-2無功能（因?yàn)閡nMask狀態(tài)太短，細(xì)胞IL-2R無法捕捉暴露出來IL-2）。

當(dāng)組裝為PD1-IL2Ra-IL2時(shí)，PD1抗體和靶細(xì)胞表面的PD1分子結(jié)合，unMask狀態(tài)的PD1-IL2Ra-IL2能夠被細(xì)胞表面的IL-2R結(jié)合，從而執(zhí)行IL-2的生物學(xué)功能。

這個(gè)設(shè)計(jì)的要點(diǎn)在于通過靶向性，以及通過IL2Ra的掩蔽降低了IL-2分子的毒性，即PD1靶向性降低IL2蛋白毒性的同時(shí)提升了IL2的有效靶向活性。不過，這種設(shè)計(jì)可能對(duì)IL-2的活性造成較大負(fù)面影響！

2、IL-2蛋白的設(shè)計(jì)

圖2：IL2wt、IL2v-Fc的PBMC細(xì)胞亞型stat5激活實(shí)驗(yàn)

圖2A-C，再生元做了2個(gè)融合蛋白，分別串聯(lián)了兩個(gè)不同的IL-2蛋白，一個(gè)是野生型IL2+Fc；一個(gè)是突變的IL2v+Fc，這里的IL2v是類似羅氏的IL2v分子。

在Treg、CD8+T、NK三種細(xì)胞中，對(duì)兩種融合蛋白激活細(xì)胞stat5信號(hào)通路的能力進(jìn)行測(cè)試。結(jié)果可見，兩個(gè)IL-2對(duì)CD8+T、NK的激活能力相似，而野生型IL-2激活Treg細(xì)胞的能力更優(yōu)。

D圖是三種細(xì)胞IL-Rα的本地表達(dá)的流式數(shù)據(jù)，可以看出Treg的IL2Ra表達(dá)略高于CD8+T細(xì)胞。這個(gè)數(shù)據(jù)僅供參考，免疫細(xì)胞表面marker會(huì)因?yàn)椴煌瑮l件而發(fā)生變化，類似某種動(dòng)態(tài)表達(dá)的狀態(tài)，在研究與實(shí)驗(yàn)中對(duì)于免疫細(xì)胞的表面marker認(rèn)知不能太固定。

圖2E-F：動(dòng)物荷瘤試驗(yàn)

研究者又在小鼠腫瘤模型上對(duì)兩種蛋白進(jìn)行測(cè)試（圖E-F），結(jié)果非常令人驚奇，野生型IL-2的抑瘤效果非常明顯，而突變型的IL-2對(duì)腫瘤的增殖幾乎沒有任何作用，這一數(shù)據(jù)也體現(xiàn)在了存活率上（圖G）。

圖2H-I：細(xì)胞激活的組織差異研究

基于動(dòng)物試驗(yàn)的得結(jié)果，研究者探討了兩種IL-2激活正常淋巴細(xì)胞和腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞的能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩種IL-2都能刺激CD8+細(xì)胞增殖，但是野生型IL-2可以刺激腫瘤特異的CD8+細(xì)胞，而突變IL-2則能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠。

結(jié)果表明，偏向IL-2Rβ/γ的IL-2可導(dǎo)致 CD8+ T 細(xì)胞和 NK 細(xì)胞的全身擴(kuò)增，但這些細(xì)胞不一定是腫瘤特異性的。因此，IL-2蛋白的設(shè)計(jì)非常重要，要能夠有效刺激腫瘤反應(yīng)性 T 細(xì)胞，并控制腫瘤生長。

這也可能是后續(xù)再生元選擇野生型IL-2進(jìn)行后續(xù)藥物設(shè)計(jì)的重要原因之一！

3、融合蛋白的設(shè)計(jì)

圖3 分子設(shè)計(jì)與IL2親和力

圖3 再生元這個(gè)分子的形式，PD1抗體+Fc段連著的IL2Ra再加上一個(gè)IL2（Fc-(G4S)3-IL2Ra-(G4S)5-IL2）。總的來說比較復(fù)雜，體積也很大，親和力顯示常規(guī)情況下不與IL2Ra結(jié)合（因?yàn)镮L2被IL2Ra阻礙了），同時(shí)由于這個(gè)設(shè)計(jì)使得它的IL2Rβ、IL2Rβγ親和力也較弱。

基于上述研究，從分子特性上可以將它定義為一個(gè)PD1抗體與IL2βγ的融合蛋白，最終結(jié)果類似于羅氏的那款偏向性融合蛋白，但I(xiàn)L2端親和力低。

圖4 stat5細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞因子釋放

圖5-細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

圖4、圖5，是文獻(xiàn)中的一系列的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，從圖4通過不同細(xì)胞系對(duì)PD1-IL2Ra-IL2及其對(duì)照品的stat5活化、TNFα釋放來判斷分子對(duì)于T細(xì)胞的功能，到圖5中動(dòng)物模型中特異性CD8T細(xì)胞的活化與增殖。

這兩個(gè)數(shù)據(jù)，非常明確的展現(xiàn)出分子的PD1靶向性與對(duì)CD8+T細(xì)胞明確效果。

圖6（IL2-Fc、IL2v-Fc動(dòng)物實(shí)驗(yàn)）

圖7（PD-1-IL2Ra-IL2多個(gè)模型的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)）

圖6和圖7是各種不同給藥設(shè)計(jì)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，我這里把IL2、IL2v和PD-1-IL2Ra-IL2的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)放一起的原因是讓各位能更加直觀的看出PD1在這個(gè)分子中的重要性，在很多動(dòng)物模型中PD-1-IL2Ra-IL2展現(xiàn)出了很好的抑瘤效果。但請(qǐng)注意這里的劑量存在一些對(duì)比之后才能察覺的魔鬼細(xì)節(jié)，比如B16F10、MC38兩個(gè)細(xì)胞荷瘤的hPD-1鼠的劑量都不高。

那么為什么PD1那么重要呢？讓我們來看看下面的圖8。

再生元檢測(cè)了各個(gè)區(qū)域的CD8+細(xì)胞中IL2Rα、與PD1表達(dá)，這里可以發(fā)現(xiàn)在腫瘤中CD8+T的PD1、IL2Rα表達(dá)均出現(xiàn)了比較高的表達(dá)，這種變化是他們認(rèn)為的PD1抗體與IL2融合后會(huì)有更好效果的一種證據(jù)。

文章還將PD-1-IL2Ra-IL2與TCE、CAR-T分別聯(lián)用，也做出了很不錯(cuò)的結(jié)果，請(qǐng)感興趣的同學(xué)自行翻閱。

4、滄漠說藥

從這篇文章中，我們可以看出從最初的分子設(shè)計(jì)與分子每一段上的功能，再生元均仔細(xì)的設(shè)計(jì)了大量實(shí)驗(yàn)去驗(yàn)證，充分的確切了這個(gè)分子的功能，確切地將CD25+ PD1+CD8+T細(xì)胞作為藥物的重要靶細(xì)胞。

本文還設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)與PD1抗體、TCE、CAR-T聯(lián)用，設(shè)想藥物后續(xù)更廣闊的用途。

圖9再生元制作的各種IL2-PD1-IL2Ra融合蛋白

這篇文章作為一個(gè)細(xì)胞因子融合藥物研發(fā)的入門思路學(xué)習(xí)很不錯(cuò)，從圖9就可以體會(huì)到作者在這一篇文章里付出的心血，文章中很多實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)非常好，舉個(gè)例子比如圖5流式圖坐標(biāo)中的CELL/mg，他們?yōu)槭裁匆@樣標(biāo)我甚至可以感同身受，文中很多同類實(shí)驗(yàn)在近似思路下我親手做過，他們的嚴(yán)謹(jǐn)與精確是能透過這些數(shù)據(jù)與細(xì)節(jié)感受到的。他們是一群非常高水平的研究者，這篇文章的內(nèi)容與實(shí)驗(yàn)思路值得我去好好學(xué)習(xí)與思考…….

這篇文章作為一個(gè)細(xì)胞因子融合藥物研發(fā)的入門思路學(xué)習(xí)很不錯(cuò)，但在最后我要指出，藥物研發(fā)一定要多看文獻(xiàn)！

比如我仔細(xì)看完信達(dá)專利以后，對(duì)比圖9中信達(dá)專利中的2149，再生元難道沒有發(fā)現(xiàn)兩者所采用動(dòng)物模型幾乎一致的情況下，超過十倍的最高劑量差距么？這是因?yàn)槭裁茨兀浚浚?/p>

這是個(gè)巨大的魔鬼細(xì)節(jié)，信達(dá)的IL2α-PD1在進(jìn)入臨床變身IBI363的時(shí)候劑量到了3mg/kg，再生元這個(gè)東西動(dòng)物模型只到1.5mg/kg，他們的臨床劑量會(huì)是什么樣呢，它的效果怎么樣呢？這值得持續(xù)追蹤。

在最后補(bǔ)上原文鏈接，建議各位有興趣的可以多看看原文，學(xué)習(xí)其中實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)細(xì)節(jié)，再對(duì)比羅氏和信達(dá)的專利，仔細(xì)揣摩不同IL2性能的細(xì)節(jié)。

原文DOI：org/10.1016/j.xcrm.2024.101747

信達(dá)專利號(hào)：WO2023045977A1

羅氏專利號(hào)：WO2024153722A1

5、敬請(qǐng)期待！

滄漠老師正在準(zhǔn)備面向一線研究與實(shí)驗(yàn)人員的系列虛擬課題，提供一系列可以交流與學(xué)習(xí)的題目，爭取演化為一個(gè)可以讓研究人員在一線工作中更好的學(xué)習(xí)成長的討論平臺(tái)！