開發新藥是一個復雜的過程，可能需要 12 至 15 年的時間，成本超 10 億美元。藥物發現過程的臨床前階段，從最初的靶標識別和驗證，到分析方法開發、高通量篩選、命中識別、先導優化等，最后選擇用于臨床開發的候選分子。

1. 藥物研發概況

藥物研發的驅動因素是存在未滿足的臨床需求。最初通常發生在學術界，并提出一個治療假設，即蛋白質或通路的抑制或激活將在疾病狀態下產生治療效果。由此，確定一個靶標，在進入先導藥物發現階段之前可能需要進一步驗證，以證明藥物發現工作的合理性（圖 1）。在先導藥物發現過程中，隨后會進行深入的研究，以找到類藥性的小分子或生物治療劑（通常稱為候選藥物，Candidate）；該藥物將進入臨床前階段；如果成功，則進入臨床開發階段（圖 2）；并最終成為上市藥物。

圖1. 從靶標識別、驗證到候選藥物發現過程及預期時間。

圖2. 藥物發現篩選分析概述。

2. 靶標發現

藥物在臨床上失敗的主要原因有兩個：第一是它們不起作用，第二是它們不安全。因此，開發新藥最重要的步驟之一是靶點發現和驗證。靶標是一個廣泛的術語，可以是一系列生物實體，例如蛋白質、基因和RNA。一個好的靶點需要有效、安全、滿足臨床和商業化需求，最重要的是“可成藥”。“可成藥”靶點可接近推定的藥物分子，無論是小分子還是較大的生物制品，并且在結合后引發可在體外和體內可測量的生物反應。

如今可用生物醫學數據的數據挖掘導致靶標的顯著增加。在這種情況下，數據挖掘是指使用生物信息學方法，不僅幫助識別，而且幫助選擇和優先考慮潛在的疾病靶標。可用數據，包括出版物和專利信息、基因表達數據、蛋白質組數據、轉基因表型和化合物分析數據。涉及方法，包括檢查 mRNA/蛋白質水平，以確定它們是否在疾病中表達以及它們是否與疾病惡化或進展相關。另一種有效的方法是尋找遺傳關聯，例如，遺傳多態性與疾病或疾病進展的風險之間是否存在聯系，或者多態性是否具有功能。最后，還可以使用表型篩選來識別疾病相關靶標。

3. 靶標驗證

一旦確定靶標，靶標就需要受到全面驗證。驗證技術的范圍從體外工具到動物模型，再到在疾病患者中調節所需靶標。雖然每種方法本身都是有效的，但多重驗證方法顯著提高了結果的置信度（圖 3）。

圖3. 靶標識別和驗證是多功能的研究過程。

靶標驗證常見的技術包括基因敲除、基因敲減、轉基因動物模型、單克隆抗體、和化學基因組等多種方法。

4. 命中分子(Hit)發現

在靶標驗證過程之后，在藥物發現過程的命中識別和先導化合物發現階段，開發了化合物篩選測定方法。“命中化合物”即是在化合物篩選中具有所需活性且其活性在重新測試后得到確認的化合物。存在多種篩選范例來鑒定命中分子。

高通量篩選(High throughput)，通常在 384 孔及以上的板中測定分析大量化合物。大型化合物庫通常由大型制藥公司運營，但較小的化合物庫也可以在制藥公司或學術界運營，這有助于降低成本。商業公司現在還嘗試使用計算機輔助分析來覆蓋更廣泛的化學空間，以減少篩選的化合物數量。

特定文庫篩選，先前鑒定為擊中特定類別靶標（例如激酶）的化合物、以及具有相似結構的化合物。提供更便宜的途徑來尋找命中分子，但可能無法發現全新的結構，并且可能難以獲得專利授權。

片段篩選，將小化合物浸泡到晶體中以獲得低(mM) 活性的化合物，然后將其用作較大分子的構建模塊。

結構輔助藥物設計，使用晶體結構輔助設計分子。在這種情況下，通常會將化合物對接到晶體中，并使用它來輔助預測可以在何處添加修飾以提供增強的效力或選擇性。

虛擬篩選，使用對接模型：用蛋白質的 X 射線結構篩選虛擬化合物庫，或者基于已知的配體的藥效團篩選，作為開發進一步化合物的基礎。還可以特定文庫篩選提供起始結構，而無需使用昂貴的大型庫文庫篩選。

生理活性篩選，一種基于組織的方法，用于確定藥物在組織而不是細胞或亞細胞水平上的作用，例如肌肉收縮力。通量較低的定制篩選。旨在更接近地模擬體內的復雜性，而不是僅僅查看單個讀數。

親和力篩選（包括 DEL庫，質譜/核磁共振等篩選），通過與已知蛋白質靶標結合來篩選較小化合物（片段），以尋找具有與靶標結合活性的化合物。

5. 檢測方法開發

一般來說，細胞測定應用于多種類別的靶標，例如膜受體、離子通道和核受體，并且可根據化合物活性生成活性讀數。相比之下，生化測定則主要應用于受體和酶類靶標。也可簡單地測量測試化合物對靶蛋白的親和力。生化和基于細胞的測定的檢測范例均已成功用于識別命中分子和候選分子。

測定形式的選擇取決于藥物靶蛋白的生物學機制、基本的設備儀器基礎設施、科學家的經驗、是尋找抑制劑或激活劑、及篩選規模等。例如，GPCR 篩選可測定配體與受體的親和力，可測量 G 蛋白的鳥嘌呤核苷酸交換；還可以測量化合物介導的信號的變化：許多第二信使，包括鈣、cAMP 或磷酸肌醇，或下游報告基因的激活。無論選擇哪種檢測形式，都需要考慮以下因素：

1. 測定的藥理學相關性。如果可行，應使用對所研究的靶點具有活性的已知配體進行研究，以確定測定藥理學是否可以預測疾病狀態，并表明該測定能夠識別所需效力和作用機制的化合物。

2. 測定的重現性。在化合物篩選環境中，要求該測定在各個測定板、各個篩選日期以及可能運行數年的程序內、在整個藥物研發的持續時間內可重復。

3. 測定費用。化合物篩選測定通常在微孔板中進行。在學術界或相對少量的化合物測定通常在 96 孔或 384 孔微量滴定板中進行，而在工業或 HTS 應用中，測定在 384 孔或 1536 微孔板中進行格式化，測定體積小至幾微升。在每種情況下，選擇測定試劑和測定體積以最小化測定成本。

4. 測定質量。測定質量通常根據Z' 因子確定。這是一個統計參數，除了考慮測定中的信號窗口之外，還考慮測定中高信號和低信號周圍的方差。Z 因子已成為測量板基上測定質量的行業標準方法。Z因子的范圍是0到1；Z 因子大于 0.4 的測定被認為對于化合物篩選來說是適當穩健的，盡管許多研究組更喜歡使用 Z 因子大于 0.6 的測定。除了 Z 因子測定質量外，還通過在每次測定中納入藥理學對照來監測質量。如果標準化合物的藥理學落在預定限度內，則認為測定是可接受的。檢測質量受多種因素影響。一般來說，高質量的檢測是通過執行簡單的檢測方案（步驟少）、最大限度地減少檢測中的清洗步驟或板與板之間的試劑轉移、使用穩定的試劑和生物制品以及確保用于執行檢測的所有儀器來創建的。通常通過實驗室自動化控制來實現。

5. 化合物在測定中的作用。化學庫通常儲存在有機溶劑中，例如乙醇或二甲基亞砜 (DMSO)。因此，需要開發對測定中所用溶劑的濃度不敏感的測定。通常，基于細胞的測定不能耐受高于 1% DMSO ，而生化測定可以在高達 10% DMSO 的溶劑濃度中進行。還應確定檢測中的假陰性和假陽性命中率。最后，應考慮化合物篩選濃度。用于發現命中的化合物篩選測定通常在1–10 μM化合物濃度下運行。在這些濃度下，可以鑒定活性高達 40 μM 的化合物，可以改變測試濃度來鑒定具有更高或更低活性的化合物。

在開發 HTS 測定時（可能需要在幾周內篩選數百萬個分子），最佳方案是首先篩選化合物的訓練集，以驗證測定的性能是否可接受。圖4顯示了在1536孔HTS測定中針對中國倉鼠卵巢細胞中表達的組胺H1受體的12000個化合物的篩選。通過重復兩次或三次，以識別測定中的命中率、測定的再現性以及測定中的假陽性和假陰性命中率。目前，已經開發了統計包來識別這些參數。

當進行篩選以檢測激動劑配體時，水母發光蛋白(Aequorin，能夠結合游離的鈣離子)測定的命中率通常小于篩選化合物的 0.5%，而統計測定截止值為標準激動劑配體所見的激動劑信號的 5% 或更低。在這種檢測形式中，假陽性和假陰性的命中率非常低。

對于拮抗劑篩選，水母發光蛋白測定中的命中率通常為以大于 25% 抑制的活性截止，占篩選的化合物的 2-3%。這是所有篩選測定的常見現象。拮抗劑或抑制劑形式的命中率往往高于激動劑測定中的命中率，因為拮抗劑測定（通過檢測測定信號的減少來定義）還將檢測干擾信號系統產生的化合物。完成穩健性測試后，檢測將進入 HTS。在 HTS 期間，每天要篩選多達 200 個檢測板，通常使用復雜的實驗室自動化技術。在篩選過程中，根據測定板上的 Z' 和標準化合物的藥理學差異來測定性能，如果這些質量控制措施超出預定限度，則測定板失敗并重新篩選（圖 5）。

圖4. 水母發光蛋白高通量篩選：驗證測試 GPCR 拮抗劑測定（1536 孔）。將表達組胺 H1 受體和鈣敏感發光蛋白水母發光蛋白的細胞分配到 1536 孔微量滴定板中。一式兩份篩選總共 12,000 種化合物，以檢測激動劑配體（左圖）和拮抗劑配體（右圖）。在激動劑測定（左圖）中，沒有藥物反應以紅色表示，對配體組胺最大濃度的反應以藍色表示，化合物數據以黃色表示。正如激動劑測定中常見的那樣，由于不存在假陽性，命中率非常低。在拮抗劑測定中（右圖），在不存在測試化合物的情況下對組胺的反應以紅色表示（基礎反應），對組胺拮抗劑最大濃度的反應以藍色表示（100%抑制），化合物數據以黃色表示。正如在基于細胞的抑制劑測定中常見的那樣，由于測定干擾和化合物活性的結合，化合物數據存在顯著的分散分布。真正的活性在 40% 至 100% 抑制范圍內相關。兩種檢測均具有出色的 Z'。

圖5. 高通量篩選中的質量控制 (QC)。為了確保化合物篩選活動中篩選數據的控制，每個測定板通常包含許多藥理學對照化合物。(A)每個384孔板包含16個含有低對照的孔和另外16個含有EC100濃度的藥理學標準品的孔，其用于計算Z'因子。Z' 系數低于 0.4 的板將被重新篩選。(B)每個板還包含 16 個 EC 50濃度的藥理學標準品孔，以監測測定中的差異（菱形）。(C)為所有通過藥理學標準 QC 的板布局生成熱圖，以監測整個測定板的活性分布。在整個篩選板上看到活動的應隨機分布。由于活性孔聚集在板的中心，因此所提供的板將失敗并重新篩選。

6. 確定命中系列化合物

一般化合物庫的分子遵循Lipinski五法則，分子量小于400、和clogP小于 4（親脂性的量度，影響體內吸收），具有這些特征的分子被稱為“類藥物”，這是因為大多數臨床上市藥物的分子量小于 350，cLogP 小于 3。以簡單的小分子作為先導物優化來啟動藥物發現計劃至關重要，以提高效力和選擇性，通常涉及增加分子量，這反過來又會導致安全性和耐受性問題。

一旦通過虛擬篩選或 HTS 獲得了一些命中結果，藥物發現團隊的首要任務就是嘗試確定哪些化合物最適合研究。這種分類過程至關重要，因為在一個大型庫中，團隊可能會留下許多可能的命中，他們需要減少、確認這些命中并將其聚類為系列化合物。實現這一目標需要采取幾個步驟。首先，盡管隨著化合物庫質量的提高，這不再是一個問題，但文庫監管員已知在 HTS 中頻繁出現的化合物需要從進一步考慮從中刪除。其次，已經開發了許多計算化學算法，根據結構相似性對命中進行分組，以確保在提出的化合物列表中代表廣泛的化學類別。使用這些算法對化合物命中列表進行分析，可以根據化學簇、效力和配體效率等因素來選擇命中，從而了解化合物與其分子大小的結合效率（對數效力除以“重要原子數”，即分子中的非氫原子）。

下一步，則是對每個命中進行主要測定，并生成劑量反應曲線。命中分子表現出正常的動力學行為很重要。表現出全有或全無響應的化合物不是以可逆的方式起作用，實際上也可能根本不與靶蛋白結合，高濃度下的活性是由樣品和測定系統的另一組分之間的相互作用產生的。可逆化合物受到青睞，因為它們的藥理作用在停藥后更容易“消失”，這是在患者中使用時的一個重要考慮因素。獲得劑量反應曲線可以生成半數最大抑制濃度(IC50)，用于比較候選化合物的效力。

新鮮的化合物樣品是非常必要的。但幾乎所有 HTS 文庫都以冷凍 DMSO 溶液的形式保存，因此一段時間后，化合物可能會降解或變性。事實上，當重新合成該化合物并用于重新測試時，有效的活性可能消失，盡管偶爾鑒定出有效的雜質可以取得進展。

通過在對目標的主要測定中生成可靠的劑量反應曲線，該階段是在二級測定中檢查幸存的命中（如果可用），以選擇最終命中。這不需要是高通量形式的測定，而是觀察化合物在功能反應中的影響，例如在第二信使測定中或在基于組織或細胞的生物測定中。在這種情況下的活性將確保化合物能夠調節更完整的系統，而不是簡單地與主要測定中使用的分離的且經常工程化的蛋白質相互作用。

在整個確認過程中，藥物化學家將尋求將化合物分組，以構成先導系列的基礎。作為該過程的一部分，將考慮每個簇的屬性，例如是否存在在許多化合物上演變的可識別的結構-活性關系（SAR），即識別具有某些部分的一組化合物或共同的化學基團，并且向該核心結構添加不同的化學基團會產生不同的效力。還將研究化學合成問題。因此，將評估制備的簡易性、平行合成的潛在適應性、以及從后期中間體產生多樣性的能力。

確定命中系列后，現在可以對多組化合物并行進行研究。這一步將包括快速生成基本的SAR 數據、并定義與活性相關的結構中的基本要素。同時，每個系列的代表性實例將接受各種體外測定，旨在提供有關吸收、分布、代謝和排泄 (ADME) 特性，以及理化和藥代動力學 (PK) 的數據（見表１）。此時可能需要進行選擇性分析，特別是針對最初制備化合物的目標類型（如果有），也很有用。例如，您可能想要抑制激酶 X，但避免激酶 Y，以減少不需要的體內副作用。此階段進行的系列數量將取決于可用資源，但理想情況下，考慮到可能的失敗，應將多個系列納入“從命中到先導”階段，以便順利進入下一階段。通常得到的命中分子對藥物靶標的效力為 100 nM–5 μM，將啟動藥物化學項目以進一步提高該分子的效力。

表１. 早期藥物發現的關鍵體外測定的參考標準

7. 命中到先導分子

此階段工作的目的是完善每個命中系列測試分析，以嘗試生產更有效和更具選擇性的化合物，并具有一定的體內模型中 PD/PK 特性。

將圍繞每個核心化合物結構進行深入的 SAR 研究，并進行測量以確定每個化合物的活性和選擇性。這需要系統地進行，并且在已知靶標結構信息的情況下，可以應用使用分子建模和 X 射線晶體學和 NMR 等方法的基于結構的藥物設計技術，以更快、更有針對性地 SAR 分析。通常還會確定目標蛋白上的結合位點。

此時的篩選包括相對高通量的測定，確定每個分子對靶標的活性及選擇性，對已知或預計存在的問題進行測定（圖6)。

圖6. 假定的藥物篩選流程。從高通量篩選 (HTS) 到候選分子確定的測定示例。

此外，必須進行更詳細的理化和體外ADME 特性分析，這些研究是并行進行的，選擇關鍵化合物進行評估。表 1顯示了要考慮的檢測類型以及合適的目標。

溶解度和滲透性評估對于判斷或排除化合物作為藥物的潛力至關重要，缺乏這兩種特性的化合物無論在初級篩選試驗中多么有效，都不太可能成為藥物。微粒體穩定性是體內代謝酶修飾然后清除化合物的能力的有用量度，也可以使用肝細胞。對 CYP450 抑制進行檢查是新化合物是否可能影響與其共同給藥的現有藥物的代謝的重要預測因素。如果這些特性中的一種或多種不理想，那么可能需要專門針對這些特性篩選更多的化合物。

達到目標效力和選擇性的關鍵化合物，以及大多數理化和 ADME 目標，應在大鼠中進行 PK 評估。在這里，當化合物靜脈給藥時，通常的目標是半衰期為 >60 分鐘，口服給藥后吸收超過 20%，盡管有時不同的目標需要非常不同的 PK 曲線。此外，需要考慮潛在毒性，hERG 通道是一種鉀電壓門控離子通道，對心臟功能和抑制很重要，可導致心臟負擔。對于 hERG，我們的理想目標是活性超過 30 uM 或至少 1000 倍的靶標選擇性。

許多滿足所述要求的這些化合物在 PK 研究中，發現靜脈給藥后具有合理的半衰期，但當給大鼠口服該化合物時，發現血漿水平較差。研發項目從命中到先導階段的一些化合物雖然本身不太可能取得進展，但能夠回答疾病模型中的問題。因此，化合物可被腹腔內給藥，實驗結果也為開發方案提供了實質性的證據。

8. 先導化合物優化階段

最后，藥物發現階段的目標是保持先導化合物的有利特性，同時改善先導結構的缺陷。此階段的化合物可被視為已滿足先導化合物優化階段的初始目標，并已準備好作為臨床前候選藥物之前進行最終表征。

一般來說，分子還需要在遺傳毒性模型（例如Ames test）和一般行為的體內模型（例如Irwin's test）中進行檢查。高劑量藥理學、PK/PD 研究、劑量線性 PK、重復給藥 PK、 尋找藥物誘導的代謝和代謝譜都需要在此階段結束時進行。還需要考慮化學穩定性問題和推定原料藥的選擇。

在此階段收集到的有關該分子的所有信息將有助于準備目標候選分子資料，與毒理學、化學制造、以及控制考慮因素一起，將構成監管提交的基礎，以允許開始人體給藥。

行業內只有10%的小分子項目可能會過渡到候選分子階段，在此前多個階段都可能失敗。這些可能包括: (i) 無法進行可靠的檢測；(ii) 沒有從 HTS 獲得可開發的命中分子；(iii) 化合物在二級或天然組織測定中表現不符合預期；(iv) 化合物在體外或體內有毒；(v) 化合物具有不良副作用；(vi) 無法獲得符合人體所需給藥方案的良好 PK 或 PD 曲線，例如，如果需要每天一次片劑，則需要該化合物具有適合實現此目的的體內半衰期；(vii) 目標位于中樞神經系統內的化合物無法穿過血腦屏障。

此外，盡管與藥物開發和臨床階段后期進行的許多流程相比，成本相對較低，但臨床前活動的風險足夠高，且距財務回報遙遠，常常使其成為一個問題。一旦選擇了候選藥物，進入臨床階段的化合物的流失率也很高，同樣只有10％的候選藥物進入市場，但在這個階段失敗的財務損失后果要高得多。關于如何通過“快速而廉價地失敗”來提高成功率，業界存在相當多的爭論。

一旦候選分子達到臨床階段，終止該項目就會變得越來越困難，因為在這個階段該項目已經成為公眾所知，因此終止會影響對公司和股東價值的信心。在臨床開發之前進行更多研究，例如改進毒理學篩選（使用失敗的藥物為這些測定提供信息）、基于全面的疾病理解建立預測轉化模型并識別生物標志物可能有助于這一努力。尤其是在后兩個領域，學術界與產業界的合作可以真正增加臨床前的價值，并最終幫助為患者帶來更有效的藥物。

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參考：

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3058157/